第二章 固定化载体筛选.docVIP

第二章试剂名称 级别 生产厂家 D-葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司 AR 南京宁试化学试剂有限公司 蛋白胨 OXOID 琼脂 上海化学试剂厂 磷酸二氢钾 广东·汕头市西陇化学厂 磷酸氢二钠 广东·汕头市西陇化学厂 考马斯亮蓝 G-250 上海生工生物工程上海有限公司 氯化钠 上海四赫维化学公司 异丙醇 天津市福晨化学试剂厂 安徽三星树脂科技有限公司 戊二醛 AR Siama 公司 蔗糖 AR 西陇化工股份有限公司 乳糖 AR 中国惠兴生化试剂有限公司 乙醇 AR 无锡市亚盛化工有限公司 氢氧化钠 AR 西陇化工有限公司 浓盐酸 AR 上海中试生化 2.1.2仪器 表2-2 实验仪器 仪器名称 规格与型号 生产厂家 酶标仪 Power Wave XS 美国BIO-TECH公司 恒温培养箱 PYX-DHS-40*50-BS 上海跃进医疗器械厂 超净工作台 SW-CJ-1B 苏州净化设备厂 电子天平 BP110S Sartorias 精密计 Cole Parmer Cole Parmer Instrument Co. 隔水式电热恒温培养箱 PYX-DHS 上海市跃进医疗器械一厂 手提式压力蒸汽灭菌锅 YXQSG41280 上海医用核子仪器厂 电热恒温干燥箱 HG202-1 南京实验仪器厂 752紫外光栅分光光度计 752 上海精密科学仪器有限公司 快速混匀器 SK-1 常州国华电器有限公司 高速离心机 TGL-16G 上海安亭科学仪器厂 β-呋喃果糖苷酶Fru6Aspergillusoryzae arilatensis NJEM01 ，本实验室筛选获得。 工程菌 E.coli BL21(DE3)/pET22b-fru6,本实验室构建。 培养基：LB氨苄固体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉18，灭菌冷却后加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。 LB氨苄液体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10,琼脂粉18，灭菌使用时加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。 从冻存管中转接重组菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-fru6于LB氨苄固体培养基上，37℃培养12h后，挑取一环菌于LB氨苄液体培养基中37℃，200r/mim,培养12h。以2%（v/v）的接种量接入50ml新LB氨苄液体培养基中于37℃，200r/mim培养2h后，加入IPTG致终浓度为1mmol/l，30℃诱导培养8h。培养结束后将培养液以5000/mim，离心15min，收集上清即为β-呋喃果糖苷酶Fru6β-呋喃果糖苷酶Fru6μl加入950μl蔗糖底物（1mol/l ，PH6.47PBS缓冲）中，置于35℃反应30min ，反应后煮沸10min。 酶活力单位的定义为：35℃，PH6.47条件下，每分钟水解蔗糖底物（1mol/L）产生1μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U即umol/(ml.min)）。 2.2.3 固定化载体材料的筛选 2.2.3.1 大孔树脂的预处理（见图2-1） 称取大孔树脂1g 95%乙醇在30℃，200rpm摇床中浸泡2h 加入5ml PH7的磷酸缓冲混合，在30℃，200r/mim摇床中放置12小时 取出烘干，预处理完成 图2-1 2.2.3.2 大孔树脂初步筛选 大孔树脂 树脂类型 功能基团 结构 D301 弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2 苯乙烯-二乙烯苯强碱性阴离子交换树脂–N+(CH3)3 苯乙烯-二乙烯苯大孔吸附树脂交联聚苯乙烯大孔吸附树脂交联聚苯乙烯大孔吸附树脂交联聚苯乙烯大孔吸附树脂交联聚苯乙烯碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2 苯乙烯-二乙烯苯碱性阴离子交换树脂–NH2 丙烯酸甲脂碱性阴离子交换树脂–NH2 丙烯酸甲脂碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、=N、=N-环氧系碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、≡N酚醛 图2-3 ：D301、D311、D318、D330和D345固定化效果 从图2-3可以看出，D301、D311和D318三种大孔树脂固定化效果要比D330和D345好。D301、D311和D318三种载体的表面都是伯胺基，而D330和D345两种载体上表面基团有伯胺、仲胺和叔胺，可能仲胺与叔胺不能与戊二醛发生交联，这两种载体的伯胺基少于其他三种，所以固定化效率不及带有伯胺基的树脂。因此我们实验选择带有伯胺基的大孔树脂