第六章-目基因筛选和DNA文库构建.pptVIP

例如 将基因组DNA用多种限制性内切酶切割， 通过Southern杂交 则 将SpeI切割的基因组DNA中的~8.3kb片段回收，用于构建DNA文库 发现目标基因在8.3kb SpeI片段上 哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2 E.coli 4639221bp p=99% 平均10kb n=2134 若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段, 则 n = 69075 若用占 总DNA 1/10 区域的限制性片段(10kb)， 则 n = 199 一、cDNA克隆用的mRNA 第二节 cDNA文库的构建 1. mRNA的完整性 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 ?10～?100kDa蛋白 指导合成目的多肽的能力 利用免疫沉淀和SDSmRNA的大小 500bp～8kb 大部分 1.5～2kb 总mRNA制剂指导合成cDNA第一链长分子的能力 合成的cDNA也应为上述范围 脱氧胸苷酸12-18聚体[oligo(dT) 12-18] 引物可刺激cDNA第一链的放射性活度掺入量至少增加30倍 2．mRNA的丰度 高丰度mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白 在特定细胞中占50-90% 低丰度mRNA ?0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 文库应足够大，鉴定和分离困难 3．mRNA的富集 按大小对mRNA进行分级分离 分离不同大小的mRNA（先变性，如氢氧化甲基汞，后梯度离心，蔗糖） 体外翻译，检测每份中的比活 cDNA的分离级分离 近年来多采用此方法，特别是大mRNA，可避免降解mRNA, agarose分离大小易辩 多聚核糖体的免疫学纯化法 用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体 · 免疫亲和柱/A蛋白-Sepharose柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到A蛋白-spharose柱上，随后用EDTA解离下来，通过oligo(dT)层析分离mRNA。 · 此法分离的mRNA只占总mRNA的0.01-0.05% · 并非都可用，根据材料\来源\特异性来选择 反转录酶 AMV (42℃) M-MuLV (37℃) RNase H RNase H弱 长mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求浓度高 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 RNase 抑制剂 AAAAAAA mRNA 5 3 TTTTTTTT 二、cDNA第一链的合成 cDNA 1．自身引导法 三、cDNA第二链的合成 2. 置换合成法 有效 无须进一步纯化 不需用S1酶，否则会导致cDNA的大量损失 问题： 如何脱帽以便进入载体 5’端cDNA不能合成（少几个Nt） 有可能仍形成发夹结构 3. 第二链引导合成 Okayama-Berg方法 4. 引物-衔接头合成法 四、ds cDNA的分子克隆 1.同聚物加尾 问题： 只对质粒有效，文库不易保存和复制。 尾的长短不一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。 2．合成接头和衔接头 cDNA 合成接头 (含酶切位点) 酶切 NotI, SalI 与载体连接 Optional: methylation 接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次) 先甲基化ds cDNA，再连接接头 用衔接头替换接头 用衔接头替换接头 3. 其他方法 (1) mRNA-cDNA杂交体克隆 mRNA cDNA AAAA AAAA RNA 末端加尾效率 只及DNA的1/10 合成第一链后, 加尾, 与带dT尾的载体退火, 在宿主体内, 可除去RNA, 代之以DNA 优点: 无须合成第二链, 序列完整 但效率 1/10 (2) 依次连加 不同接头 (3) RACE random amplification of cDNA ends cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆 筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆， 而RACE可产生大量独立克隆 mRNA cDNA TTTTTTTT-QI-QO AAAAAAA A. 经典RACE 3‘末端克隆 TTTT