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第二章 蔬菜内生放线菌的分离 23 第二章 蔬菜内生放线菌的分离 第一节 表面消毒和表面消毒检验方法的研究 为了保证分离的是植物内部微生物 减少植物表面微生物的干扰 本节对 植物材料的表面消毒和表面消毒检查进行了比较和研究 1.1材料 1.1.1供试蔬菜 大连旅顺蔬菜保护地茄子 采集后立即使用 1.1.2分离培养基 YCED培养基 初筛培养基 抑制剂浓度为每L培养基中含有250U的链霉素 和50mg的重铬酸钾 培养基配法参见附录 1.1.3研磨缓冲液 PBS缓冲液 配法参见附录 1.2方法 1.2.1植物材料的清洗 洗净供试材料的浮土 用洗涤剂浸泡 30min流水冲洗30min用滤纸吸干 表面的水分 1.2.2材料的表面消毒 对茄子的根 茎 叶各部分 分别用下面的方法表面消毒 1 用75%乙醇浸泡3min然后用12%NaClO中浸泡15min无菌水磁力搅 [1] 拌 下浸洗5次 每次5min 2 用75%乙醇浸泡3min然后用0.1%HgCl中浸泡15min无菌水磁力搅 2 拌下浸洗5次 每次5min 蔬菜内生放线菌的分离和生物活性初探 24 1.2.3表面消毒的检验 1无菌水检验法 取最后一次清洗后的无菌水200L涂布于各分离培养 基培养皿上 28下培养36天 2 组织印记法 表面消毒后的材料 取少许的组织块直接放到分离培养 基培养皿上 28下培养36天 1.2.4分离培养 1 表面消毒后的各个植物组织部位 无菌条件下用PBS缓冲液研磨 研 磨液8层无菌纱布过滤后取200L直接涂布于各分离培养基培养皿上 28下 培养36天 2 表面消毒后的植物根和茎部组织块 用无菌手术刀切割产生创伤面 将创伤面紧贴分离培养基培养皿上 28下培养36天 1.3结果和讨论 1.3.1两种表面消毒剂和两种表面消毒检验方法的比较结果 表2-1和表2 2分别列出了茄子不同组织部位消毒检验培养时菌落出现的 数量和时间 由表中数据可见 使用两种表面消毒剂消毒后 表面消毒检验培 养皿中出现的菌落数量极少 说明植物表面微生物对分离培养过程的干扰小 分离培养皿中的菌落绝大部分应为内生微生物 只要对于少数表面消毒检验培 养皿中出现的菌落给予排除 就可以保证所分离的菌落为植物内生菌 表面消毒剂的评价标准为 表面消毒检验培养皿中出现的菌落数量越少 菌 落出现的时间越晚 说明该表面消毒剂的消毒效果越好 表面消毒检验方法的评价标准为 表面消毒检验培养皿中菌落数量越多 菌 落出现的时间越早 说明该表面消毒检验方法的灵敏度越高 在消毒检验培养中 使用0.1 HgCl消毒比使用 12 NaClO消毒出现的 2 菌落数量少 出现时间晚 所以0.1 HgCl的消毒效果好于12NaClO鉴于 2 第二章 蔬菜内生放线菌的分离 25 升汞的消毒能力本来就强与次氯酸钠 该结果很易理解 比较无菌水检验和组织印记检验这两种表面消毒检验方法 组织印记法比无 菌水检验法菌落的数量多 出现的时间早 说明用组织印记法检验表面消毒更 为灵敏 可能是因为消毒后的组织块和培养基有较长的接触时间 较大的接触 面积 如果消毒不彻底 组织块表面的菌含量会远高于洗涤水中的菌含量 在表面消毒检验过程中 检验所用的组织块存在裸露的切口 长时间培养时 组织液会渗出 这时出现的菌落实际上已是内生菌落 影响对检验结果的正确 判断 所以使用组织印记法检测表面消毒效果时 培养时间最好不要持续太长 根据上述实验结果和讨论 在内生菌的实际分离过程中 采用的表面消毒检验 方法为 将表面消毒后的组织块在