ELISA检测.doc

ELISA检测?-----?固相捕获法测IgM抗体 ?在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。???? 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下：???? 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。??? 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。??? 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。??? 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。??? 5．加入酶底物，温育显色测定 ??? 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。样本稀释后，上述产生干扰作用的非特异IgM含量减少，而特异IgM由于处于相应病原体的急性感染期，滴度很高，一定稀释后，不会有明显影响，况且，在某些病原体如HBV的慢性感染阶段，IgM类特异抗体也能持续存在，只不过滴度要低很多。???? 因此，如不对血清样本稀释，就直接检测，即使是没有非特异IgM的干扰，阳性测定结果也没有急性感染的诊断价值。现在，有些试剂生产厂家，为了迎合临床实验室减轻劳动强度、简便操作的要求，生产了不需对样本进行稀释的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA试剂盒，现有不少实验室也在使用。鉴于上面提到的原因，我们建议临床实验室在做抗HAVIgM和抗HBc lgM等类检测时，应使用对样本进行稀释的试剂盒，以保证检测的临床价值。 酶联免疫吸附测定ELISA结果判定的常用缩写 ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。???? 可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内应用的ELISA试剂盒绝大部分是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部分用于。???? FP，hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值(cut-off)。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线(又称标准曲线)。???? 实验室进行室内质控时使用。???? 下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写：???? (1)S／CO：其中S为sample(样本)或specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其他ELISA定性测定模式中，当S／CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。???? (2)S／N或P／N：其中S同(1)，N为negative(阴性对照)的简写，P为patient(患者)的简写。较早的试剂盒很多都使用S／N或P／N≥2．1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S／CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照(N)的2．1倍视为