实验五：分子杂交.ppt

实验五 微生物群落结构分析中的分子杂交技术 实验原理： 群落结构探针杂交的原理： 复杂环境样品，通过LP-RAPD获得的指纹图谱，电泳相同位置的条带，序列可能不同 直接以LP-RAPD指纹图谱分析群落结构之间的相似性，会高估其真实相似性 LP-RAPD产物标记为混合探针 与LP-RAPD指纹图谱杂交，通过杂交图分析 实验目的 在序列水平上平行比较微生物群落结构的差异 动态检测某个微生物群落结构的动态变化 Southern-Blot (地高辛DIG-dUTP)探针 实验 主要实验材料 分析比较10 例儿童和4例仔猪肠道微生物LP-RAPD指纹图谱的差异 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche, Germany） 真空转迹系统（Biometra,Germany） 杂交箱（Thermo Hybaid,UK） 实验过程： 探针标记 DIG-dUTP PCR labeling mix——直接扩增标记 Klenow 酶随机引物标记 PCR产物直接过柱纯化，测定浓度 ~3 ?g PCR纯化产物 + 4 ?l标记 mix 标记反应: 37?C, 20 h 实验过程： 电泳待杂交的样品 上样量一致 转膜 溶液1（去嘌呤液）：7min,部分去嘌呤，易于变性 溶液2（变性液）： 7min, 使双链DNA完全变性，尼龙膜和NC膜只结合单链DNA 溶液3 （中和液）: 使PH值恢复中性 溶液4 （转移液20?SSC）：DNA在中性高盐条件下，转移到膜上 固定 UV固定：254-312 nm，5 min ， 20 cm 真空80?C烘烤 2 h 实验过程： 预杂交－至少3 h 目的：封闭尼龙膜上未结合DNA的空白处 预杂交液组成： 试剂盒（ High Prime Hyb） 自己调配的 实验过程： 杂交 变性DNA探针（沸水中煮10分钟）大约500 ng，立即置于冰盐混合物中 用含有探针的杂交液(25ng/ml)更换预杂交液，60℃杂交至少12 h 杂交完毕后，回收含有探针的杂交液，贮存于-20℃，每次用之前68℃变性10 min 洗膜 ① 杂交完毕后，先用50 ml 2×SSC，0.1% SDS室温洗膜两次，每次15 min ② 再用50 ml 0.5×SSC，0.1% SDS 68℃洗膜两次，每次15 min，最后进行显色反应 注意：洗膜的严谨度，影响杂交背景， 68℃为严谨条件 显色 抗原抗体反应 地高辛－半抗原 抗体连接物上带有碱性磷酸酯酶 分解显色底物NBT/BCIP，而显现出颜色反应 显色步骤： ① 在Washing Buffer 中简短洗膜1－5 min; ② 在100 ml Blocking Solution 中轻摇30 min; ③ 在20 ml Antibody Solution 中轻摇30 min (抗体连接物以1：5000稀释于Blocking Solution中)； ④ 用100 ml Washing Buffer 洗膜2次，每次15 min； ⑤ 在20 ml Detection Buffer中平衡2－5 min; ⑥ 用20 ml 新鲜配置的显色液在暗处显色 （加200 μl 的NBT/BCIP到10 ml的Detection Buffer中）。 ⑦ 显色完毕后，将膜浸于去离子水中以终止反应； ⑧ 扫描或数码相机照相记录结果； ⑨ 如果要继续杂交，千万不能使膜干了，通风厨中水浴加热DMF(二甲基甲酰胺)到58℃，将膜浸于DMF中，50－60℃ 轻摇，直至颜色完全褪去； ⑩ 双蒸水中简短洗膜，用0.2 M NaOH, 0.1% SDS 37℃洗膜2次，每次20 min; 2×SSC中简短平衡一下，直接用于再次杂交。 注意事项： 转膜时，在膜与凝胶之间尽量避免气泡产生，45度角缓慢铺胶于膜上 如果用硝酸纤维素膜，则在烘烤完毕后，操作要非常小心，膜极易破碎 显色过程中不要摇动，显色可能持续16小时 如果要二次杂交，千万不能使膜干了 用DMF 60℃洗膜，可能会持续3－4小时，洗膜不能超过67℃，否则会着火 * 上海交通大学微生物分子生态学 与生态基因组学实验室 2004.7 50 ?g/ ?l 5 mg 鲑精DNA 5 ×Denhardts 5 ml 100 ×Denhardts 0.1% 1 ml 10% SGS 0.1% 1 ml 10% SDS 5 ×SS C 25 ml 20×SSC 终浓度 100 ml 杂交液 定容至100 ml * * *