鹅黄灯台报春（改）.pptVIP

四川鹅黄灯台报春天然居群遗传多样性的AFLP分析 潘远智 教授 博导 副院长 四川农业大学风景园林学院 目 录 引 言 实验材料与方法 实验结果与分析 讨 论 2 3 4 1 引言 鹅黄灯台报春的生物特性 鹅黄灯台报春（P.cockburniana）为报春花科（Primulaceae）报春花属（Primula）二年生草本植物，主要分布在四川西部的木里、九龙、道孚、康定、丹巴等县，生长于海拔2900～4200m的高山潮湿草地和林缘，其花冠橙黄色至橙红色，6～7月开花，是一种观赏价值极高的高山花卉。 引言 研究概况 四川拥有丰富的报春花野生种质资源，花色变异非常丰富，但由于对其遗传背景、亲缘关系缺乏深入系统的研究，致使该属植物育种工作受到很大限制。近年来RAPD、ISSR等分子标记技术已被用于报春花属植物亲缘关系和遗传多样性研究，但RAPD标记的引物易受试验条件的影响，存在筛选结果不稳定、条带少等缺点，ISSR虽较为稳定，但需要相当多的引物，需多次测定才能绘制较为有用的指纹图谱。AFLP结合了以上2种方法的优点，而且能提供比RAPD与ISSR更多的基因组多态性信息，目前已被应用于多种植物的遗传多样性分析。 引言 研究目的与意义 本研究利用AFLP标记来分析四川省内鹅黄灯台报春天然居群的遗传多样性和遗传结构，以期为鹅黄灯台报春的种质资源保护和进一步的育种策略的制定奠定良好的理论基础，为报春花属植物的系统研究、杂交育种以及其它植物的相关研究提供科学的参考。 材料与方法 居群采样 在不同海拔、不同生境类型或不同地理距离地点，选取有代表性的居群，根据居群内部个体数量的多少随机选择一定数量的植株作为样本，共采集了10个居群共143个单株材料（表1）。选取新鲜无病虫害嫩叶放入封口袋中，加入变性硅胶后带回实验室内超低温冰箱中保存。 材料与方法 DNA提取与AFLP分析 采用高盐低PH值法提取叶片总DNA。0.8%的琼脂糖电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。 DNA的提取及检测 AFLP体系的建立 双酶切体系 连接体系 预扩增 选择性扩增 变性聚丙烯酰胺 凝胶(PAGE胶) 电泳与银染 采用25 μl反应体系，其中模板DNA 4.0 μl（50 ng μl-1），EcoR I／Mse I （10U μl-1）各0.3μl，10×Reaction buffer 5.0 μl，ddH2O 15.4 μl。混匀， 离心数秒后37℃反应4 h，-20℃保存 备用。 在20μl上述酶切产物中加入10 ul连接混 合液：EcoR I接头（5ρmol μl-1）2.0μl， Mse I接头（50 ρmol μl-1）2.0 μl，T4 DNA Ligase (5U μl-1)0.5μl,10×Ligation Buffer 3.0 μl，ddH2O 2.5 μl。混匀，离 心数秒后于25℃连接3 h，70℃变性15 min， 灭活连接酶，4℃保温24 h。 20 μl反应体系包括模板DNA3.0 μl，10×PCR Buffer 2.0 μl，Taq DNA Polymerase（5U L-1）0.2μl， dNTPs（10 mmol L-1）1.6μl，MgCl2（25 mmol L-1） 1.2μl，Mse I-C（50 ng μl-1）0.6 μl，EcoR I-A （50 ng μl-1）0.6μL，ddH2O 10.8 μl。混匀，离心 数秒后在PCR仪上按如下程序进行预扩增：94℃ 30s， 56℃ 1min，72℃ 1min，共25个循环，4℃保温24 h。 将预扩增产物用ddH2O稀释l0倍用于选择性扩增。20μL反 应体系包括预扩增后稀释的DNA模板4.0 μl，10×PCR Buffer 2.0 μl，Taq DNA Polymerase（5U L-1）0.25 μl，dNTPs （10 m mol L-1）1.8 μl，MgCl2（25 mmol L-1）1.2 μl， Mse I-C（50 ng μl-1）0.8 μl，EcoR I-A（50 ng μl-1）0.8μl， ddH2O 9.15 μl。混匀，离心数秒后在PCR仪上按如下程序进 行选择性扩增：94℃ 30s，65℃ 30s(-0.7℃/cyc)，72℃ 1 min， 13个循环；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1 min，24个循环；最 后4℃保温24 h，选择性扩增产物在-20℃下保存备用。 取6.0％丙烯酰胺母液60 ml（丙烯酰胺29g、N,N-亚甲基 双丙烯酰胺1g、尿素210g定容于500 ml,用普通滤纸过滤 后存于4℃冰箱），依次加入10%过硫酸铵300 μl、 TEMED 50 μl混