fascin 1基因在食管癌细胞表达上调的鉴定及其功能的初步研究word格式论文.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 Fascin 1 基因在食管癌细胞表达上调的鉴定及其功能的初步研究 2001 级硕士研究生：荣 举 导 师：李恩民 教授 许丽艳 副研究员 摘 要 食管癌是常见的恶性肿瘤，其发病机制至今不甚明了。有研究发现 HPV 感 染与食管癌的发病有关，但究竟起何作用并不清楚。为此，本研究联合运用双向 凝胶电泳、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、RT-PCR、免 疫印迹、反义核酸、裸鼠成瘤等技术手段对 HPV18E6E7 基因转染诱导的永生化 食管上皮细胞 SHEE 及食管癌细胞 SHEEmt 之间的差异表达基因进行鉴定，并初 步研究了基因的功能，以期为揭示 HPV 在食管癌发病中的作用提供新线索。 内容与方法： 1、提取 SHEE 和 SHEEmt 细胞的总蛋白，双向凝胶电泳分离，考马斯亮蓝 染色，PDQuest (version 6.2)软件分析双向凝胶电泳图确定差异表达蛋白，进行 MALDI-TOF- MS 鉴定。 2、通过 RT-PCR 确???差异表达蛋白基因的转录水平，并通过 cDNA 克隆和 DNA 测序等给予进一步确认。 3、通过免疫印迹对 SHEE 和 SHEEmt 细胞中的差异表达蛋白进行验证；通 过免疫组织化学检测差异表达蛋白在临床食管鳞癌、腺癌和正常食管上皮组织中 的表达情况。 4、在转录水平反义封闭 SHEEmt 和 HeLa 细胞中差异表达蛋白基因的表达， 观察细胞生物学特性的变化规律，初步确定差异表达蛋白的功能。 结果： 1、双向凝胶电泳和 MALDI-TOF-MS 发现，与 SHEE 中的比较，fascin 1 和 磷酸丙糖异构酶在 SHEEmt 中在蛋白质翻译层面上表现上调。 2、RT-PCR 检测发现，与 SHEE 中的比较，SHEEmt 中 fascin 1 和磷酸丙糖 异构酶在 mRNA 转录层面上均表现上调，但相比之下 fascin 1mRNA 的上调更明 2  显。测序结果显示，所扩增的 fascin 1 基因片段的序列与 GenBank 上的 fascin 1 基因一致。 3、免疫印迹检测结果显示，与 SHEE 中的比较，fascin 1 蛋白在 SHEEmt 细 胞中的表达水平明显增高；免疫组织化学检测 fascin 1 在食管鳞癌和腺癌组织表 达呈阳性，在正常食管上皮组织表达呈阴性，且部分正常食管上皮组织增殖旺盛 的基底细胞表达呈阳性。 4、构建了 fascin 1 基因编码区部分片段的反义表达载体 pcDNA3.0-fascin(－)， 并成功转染 SHEEmt 和 HeLa 细胞。 5、在 HeLa 细胞中，反义封闭 fascin 1 基因后，细胞的丝状伪足和微棘减少， 表现为聚集生长。检测结果表明，fascin 1 基因在转录水平表现为明显下调，但 在蛋白翻译水平相应性下调表现不明显。 6、反义封闭 fascin 1 基因表达对 SHEEmt 和 HeLa 细胞的生长周期未见明显 影响，SHEEmt-fascin(－)和 HeLa-fascin(－)细胞仍可在 SCID 小鼠成瘤。 结论： 1、与 SHEE 中的比较，fascin 1 基因和磷酸丙糖异构酶基因在 SHEEmt 中在 蛋白质翻译层面上均表达增高。提示 fascin 1 和磷酸丙糖异构酶可能与 SHEE 细 胞的恶性变相关。 2、与 SHEE 中的比较，fascin 1 和磷酸丙糖异构酶在 SHEEmt 中在 mRNA 转录层面上均表现上调表达，但相比之下 fascin 1mRNA 的上调更明显。 3、fascin 1 基因在食管鳞癌、腺癌组织和增殖旺盛的正常食管上皮组织基底 细胞呈阳性表达，在正常食管上皮组织呈阴性表达，进一步提示 fascin 1 可能与 食管癌的发生发展相关。 4、反义封闭 fascin 1 基因表达在本次实验中对 SHEEmt 和 HeLa 等细胞的形 态有明显影响，但对细胞的分裂增殖和裸鼠体内成瘤影响不明显。 关键词：食管癌；双向凝胶电泳；质谱；fascin 1 基因；磷酸丙糖异构酶基因； 反义核酸 3  Identification and Characterization of Fascin 1 That Upregulately Expressed in Esophageal Carcinoma Cells Postgraduate：Rong Ju Supervisor：Pro. Li En-min Associate Pro. Xu Li-yan ABSTRACT Esophageal squamous cell carcinoma is one of the most common malignancies. U