flavobacteriaceae sp.cz1127产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化 性质分析及应用word格式论文.docxVIP

Flavobacteriaceae sp.CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化、性质研究及应用摘要岩藻聚糖硫酸酯是海参体壁的重要组成成分之一，具有多种生理活性。多糖降解后一方面有利于其结构解析，另一方面有可能提高其原有活性，而酶解法是目前实现多糖降解最为理想的途径。实验室前期自主筛选出一株海洋细菌Flavobacteriaceaesp.CZ1127，其胞内能产生岩藻聚糖硫酸酯酶，可以降解多种海参的岩藻聚糖硫酸酯。本研究在此基础上，进一步对CZ1127产岩藻聚糖硫酸酯酶进行了分离纯化，并对其酶学性质及应用进行了研究。首先建立了基于pHBH法的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活定量方法：准确移取375 μL0.055%岩藻聚糖硫酸酯溶液(以pH7.020mmol/LTris-HCl缓冲液溶解，内含0.3mol/LNaCl)，加入375μL酶液，混匀后于28℃酶解反应30min，随后加入pHBH 试剂250μL，100℃反应5min，迅速冷却后于415nm处测定吸光值，根据单位时间内还原糖的产生量计算酶活。该方法酶活检测限达0.048mU，约为DNS法1/20，且方法灵敏度高、精密度高，可以满足微量测定的需求。通过CellufineSulfate亲和色谱、MonoQ5/50GL阴离子交换色谱及Superdex 7510/300GL凝胶过滤色谱等色谱技术的联用实现了对Flavobacteriaceae sp.CZ1127胞内酶液中岩藻聚糖硫酸酯酶的纯化，并对其纯度进行了鉴定。纯化得到电泳纯岩藻聚糖硫酸酯酶，酶活回收率为1.8%，纯化倍数为1476.5，SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为46kDa。对CZ1127产岩藻聚糖硫酸酯酶的酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为35℃，酶液在4℃下稳定性较好；最适反应pH为6.5，在pH6.5-9.0的范围内酶活较为稳定；酶活的启动需要NaCl的存在，且NaCl浓度为0.15mol/L时酶活最高；Cd2+、Hg2+、Zn2+对酶活有很强的抑制作用，而Ca2+对酶活有明显的促进作用。利用CellufineSulfate亲和色谱及MonoQ5/50GL阴离子交换色谱对Flavobacteriaceaesp.CZ1127胞内酶中硫酸酯酶进行了初步的纯化。对其酶学性质研究表明：该酶最适反应温度25℃，酶液在4℃下稳定性相对较好，但失活速度仍较快，24h时酶活剩余量为69.6%；最适反应pH为8.5；在pH7-8.5的范围内酶活较稳定，pH为6时酶活剩余不足10%；酶活的启动不需要NaCl的存在，但添加适量NaCl有利于提高酶活，且当NaCl浓度为0.3mol/L时酶活最高。通过调节酶液pH至6.0并在4℃下贮存48小时，硫酸酯酶活力仅残余9.7%，而岩藻聚糖硫酸酯酶酶活剩余80.3%，能够简单有效的实现硫酸酯酶的特异性消除。通过研究酶解反应过程中加酶量、酶解时间与酶解产物分子量的关系，构建了预测海参(海地瓜)中岩藻聚糖硫酸酯酶解产物分子量的反向传播-人工神经网络模型，实现了对海地瓜岩藻聚糖硫酸酯酶解过程的预测与控制。构建的BP-ANNS为单隐层人工神经网络，网络输入值为加酶量和酶解时间，网络输出值为酶解产物分子量，隐层神经元7个，隐层传递函数为logsig，输出层传递函数为purelin，训练函数为trainglm。其收敛步长为74，MSE 为0.00943，预测数据和真实值的误差平均为1.06%，能够准确预测降解产物的分子量。综上所述，本文建立了岩藻聚糖硫酸酯酶酶活定量方法，获得了CZ1127产岩藻聚糖硫酸酯酶的纯化产物并对其酶学性质进行了研究，建立了海参岩藻聚糖硫酸酯的酶解模型，为CZ1127产岩藻聚糖硫酸酯酶及海参岩藻聚糖硫酸酯降解产物的利用奠定了基础。关键词：海参；岩藻聚糖硫酸酯；岩藻聚糖硫酸酯酶；硫酸酯酶；人工神经网络Studyofpurification,characteristicandapplicationof fucoidanasefromFlavobacteriaceaesp. CZ1127 AbstractFucoidanisanimportantcomponentofseacucumberbodywall,anditpossesses aseriesofbiologicalactivitieswhicharecloselyrelatedtoitsstructure.Enzymatic degradingistheidealmethodforpolysaccharidedegradation.Wehaveisolateda marinebacteriumstrainwhichbelongstofamilyFlavobacteriaceaeandwasnamed asCZ1127,an