基因工程原理第四章课件.pptVIP

第四章 载体 第一节  大肠杆菌质粒载体 质粒 原核生物染色体外的稳定复制体,因此可利用作为克隆载体。有时，也泛指所有的环状载体DNA。 质粒在琼脂糖电泳时，常呈三条带，迁移快慢从快到慢依次是：超螺旋、线性、开环。 质粒的分类 按是否携带促进细菌接合的转移基因(tra基因)，分为接合型和非接合型 按在单个细胞内的拷贝数，分为松弛型(多拷贝)和严紧型(低拷贝) 一般来说，接合型质粒相对分子量较大，拷贝数少；非接合型质粒分子量较小，拷贝数多 质粒的复制起始决定质粒的拷贝数 质粒具有两种调控起始的主要机制 1)通过反义RNA调控 现在大部分质粒载体(ori来自ColE1质粒)的拷贝数调控方式 2)通过关键蛋白调控 质粒克隆载体的理想特性 相对分子量小(易于操作、拷贝数高、利于出现单一酶切位点) 可以在宿主细胞内产生便于选择的表型特性(便于筛选) 存在多种限制性酶的单一位点区域，且最好位于易测表型基因上(便于克隆、筛选） pUC8载体 衍生自pBR322 含有复制起始位点(ori)和另两个基因：氨苄青霉素抗性基因和lacZ’基因 Lac筛选(蓝白斑筛选) 蓝白斑筛选：pUC质粒含LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝白斑筛选。 pUC8等大肠杆菌质粒的缺点 不能操作大于10kb的DNA片段 大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组DNA分子在宿主细胞中丢失 第二节  λ噬菌体基因组载体 λ噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期 为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。 λ噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。 λ噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期 λ噬菌体随意DNA(optional DNA) λ噬菌体基因组大小为48.5kb，其中有15kb只在噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体过程(即溶源性感染周期)中必须，该片段的删除不影响噬菌体感染细菌的能力，也不影响裂解周期中新的λ噬菌体颗粒合成，称为随意DNA。 λ噬菌体载体 插入型载体(insertion vector)，部分或全部随意DNA被删除，并在删除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶切位点。 替代型载体(replacement vector)，随意DNA两侧引入限制性酶切位点，用需克隆的DNA在连入时替代随意DNA。 cos位点，λ噬菌体是一个线性分子，其两端具有12个核苷酸、序列互补的单链突出。 cos位点处可发生连接形成串联体，当所插入片段大小合适时（连接产物大小在37-52kb间)，就会通过体外包装混合物而包装到衣壳内部。否则，就会被体外包装混合物切下，不被包装。 第三节 其它载体 其它载体 用于连入更长DNA片段 用于特殊用途： 1)得到单链DNA 2)RNA表达载体 3)蛋白表达载体 用于连入更长DNA片段的载体 基因组绘图与测序需要把更长(18kb)的片段连入载体 柯斯质粒(cosmid) Fosmids 噬菌体P1载体系统(bacteriophage P1 vector) BAC(bacterial artificial chromosome) PAC(P1-derived artificial chromosome) YAC(Yeast artificial chromosome) Mega-YAC 用于连入更长DNA片段的载体 Cosmid与Fosmids Cosmid 1) 具有λcos位点的质粒，质粒大小5-8kb 2) 具有和λ噬菌体一样的感染性 3) 进入细胞后不能指导合成新的噬菌体颗粒，而是如质粒一样复制，因此重组DNA可以从克隆而不是噬菌斑中得到 Fosmids 包含了F质粒的复制起始位点和λ载体cos位点。与Cosmid相似，但拷贝数较低 酵母人工染色体(YAC) 在酵母中繁殖，是以染色体为根据。 真核染色体的三个重要组件 1) 着丝粒 2) 端粒 3) 一个或多个复制起始点 YAC载体工作原理 YAC的优点与缺点 优点：天然酵母染色体大小为230-1700kb,因此能插入上至Mb的片段 缺点：插入不稳定，克隆的DNA会存在重排现象，形成新的序列组合。 BAC BAC是基于大肠杆菌F质粒构建的。细菌F质粒是一种较大的质粒，具有插入较大片段的能力，可以克隆300kb及更长的