基于暗场成像技术分析细胞膜外基质对金纳米颗粒内吞的影响-analysis of the influence of extracellular matrix on the endocytosis of gold nanoparticles based on dark field imaging technology.docx

湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在年解密后适用本授权书。2、不保密√□。（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月摘要前人已经证明了颗粒尺寸大小、形貌、表面化学、表面电荷等物理化学性质以及大颗粒的沉降、细胞周期等因素会影响纳米颗粒的内吞效率。但以往的研究中大家都普遍认为细胞膜是细胞内环境与外环境的唯一障碍。实际上，在大多真核细胞外都存在着一层细胞膜外基质。因膜外基质层透明不易被观察，因此在以往细胞内吞的研究中被认为是物质进入细胞的障碍或被忽略，更有研究工作通过降解膜外基质来提高小分子的内吞效率。在纳米颗粒的内吞研究进展中，膜外基质对纳米颗粒进入细胞的影响至今是空白。因膜外基质对细胞的贴壁、迁移、增殖、分化等生命活动起着很重要的作用，且存在于细胞膜外，是纳米颗粒接触细胞的第一层。因此，本论文在前人研究基础上，以金纳米颗粒作为探针，利用暗场显微镜研究了细胞膜外基质对纳米颗粒内吞过程及内吞效率的影响，主要开展了以下工作：（1）第2章我们通过实时示踪单个金纳米颗粒的内吞过程，根据颗粒的运动受限程度，颗粒进入细胞可分为四个阶段，这与以往别人的研究结果不一致，新发现了内吞过程中膜外基质层对颗粒运动的影响。通过单颗粒扩散系数计算及暗场层层聚焦，发现颗粒在距离细胞膜几微米范围内运动受限，速度减慢，并且膜外基质层对颗粒扩散运动的影响与细胞系及颗粒的表面化学无关。（2）为了更加直接的证明膜外基质对金纳米颗粒内吞的影响，我们在第3章中用自身具有厚膜外基质的MG-63 细胞作为厚膜外基质的细胞模型，降解膜外基质后的MG-63细胞作为薄膜外基质的细胞模型。利用暗场显微镜半定量的证明了在相同的颗粒浓度及培养条件下，厚膜外基质的细胞对颗粒具有更高的内吞效率，暗场结果显示厚膜外基质细胞的各个层面都聚集了大量的颗粒。接着，利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)直接定量的证明了在相同条件下，厚膜外基质的细胞比薄膜外基质的细胞对金纳米颗粒具有更多的内吞量。初步说明了膜外基质促进了颗粒的内吞效率，相比之下，膜外基质变薄之后，颗粒内吞量大大降低，暗示膜外基质在颗粒内吞过程起着很重要的作用。（3）前面的工作已经证明了厚膜外基质细胞可以促进金纳米颗粒的内吞效率，暗场结果明显显示出颗粒在细胞膜外基质和细胞内都有大量的聚集。第4 章主要研究膜外基质促进颗粒内吞效率的机制。将与颗粒共培养之后的厚膜外基质细胞和薄膜外基质细胞样品，用共聚焦显微镜对各个焦面上的颗粒进行分层聚焦，发现厚膜外基质细胞在膜外基质层聚集了大量的粒子，而薄膜外基质细胞中几乎没有聚集颗粒。再者，利用共聚焦显微镜实时示踪了颗粒在厚膜外基质细胞中的聚集过程，结果显示在较短的时间内有大量的颗粒在厚膜外基质细胞中聚集，提高了细胞膜外的颗粒浓度，从而促进了颗粒的内吞量。接着，我们通过单颗粒示踪发现颗粒在膜外基质中的扩散运动受限变慢，颗粒的扩散系数接近0.1?m2/s，这个值与很多膜受体在细胞膜上的扩散系数接近，说明了颗粒扩散系数慢有利于颗粒与膜上受体的结合，从而促进了颗粒的内吞效率。而薄膜外基质情况下，颗粒的扩散系数偏大，不易于颗粒与膜上受体的结合。内吞较少。证明了膜外基质通过两方面促进颗粒内吞效率：一方面通过在膜外基质中捕获和聚集大量颗粒，提高了与细胞膜作用的颗粒浓度，高浓度可实现高的内吞效率；二是通过减慢颗粒的扩散系数，使其与膜上受体的扩散系数接近，便于受体与配体的结合，从而促进内吞量。通过能量实验和内吞抑制剂实验证明了细胞膜外基质是受体介导内吞过程的一部分，对纳米颗粒的聚集及促进内吞都是能量依赖的。（4）前人工作已证明细胞对纳米颗粒的内吞与颗粒的尺寸、形貌、表面化学都有很大的关系。第5章工作研究膜外基质促进颗粒内吞与颗粒自身的物理化学性质的关系。通过进行了50 nm、60 nm、90 nm、120 nm 金颗粒的细胞内吞实验，证明了厚膜外基质促进颗粒的内吞效率与颗粒的尺寸无关。表面化学的结果说明了细胞膜外基质促进金纳米颗粒内吞与颗粒表面化学有很大的关系，膜外基质对不同表面化学的颗粒具有