基于蛋白组学的mir-101的调控环路与靶点分析-regulatory loop and target analysis of mir - 101 based on proteomics.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 英文缩写词 (Abbreviations) 英文缩写 cDNA 英文全称 Complementary deoxyribonucleic acid 中文译名 互补脱氧核糖核酸 5-aza-dC 5-aza-2-deoxycytidine 5-氮杂-2-脱氧胞苷 ANOVA Analysis of variance 方差分析 CHAPS Cholamidopropyl dimethylammonio propanesulfonate 二甲氨基丙磺酸盐 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EZH2 Enhancer of zeste homolog 2 zeste 基因增强子同源基因 2 H3K27 Histone 3 lysine 27 组蛋白 3 第 27 位赖氨酸 miRNA microRNA 微小 RNA PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate Buffer Saline 磷酸盐缓冲溶液 PcG Polycomb group 多梳基因家族 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PVDF Polyvinylidene Fluoride Membrane 聚偏二氟乙烯膜 RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 RT Reverse transcription 逆转录作用 siRNA small interfering RNA 小干扰 RNA 基于蛋白组学的 miR-101 的调控环路与靶点研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科 博士研究生：黄 达 博士生导师：胡丽华 摘 要 第一部分 miR-101 的双向负反馈环路 目的：研究肝癌细胞中 miR-101 与 EZH2 之间的相互调控作用。 方法：通过基因功 能获得与失活策略，研究 miR-101 与 EZH2 在 mRNA 及蛋白水平上的相互关系。利 用 miRNA 前体诱导实验，证实 miR-101/EZH2 调控环路的效用并确定 miR-101/EZH2 调控环路的参与者。利用定量基因组 PCR，研究 miR-101 缺失与 miR-101 前体诱导效 率之间的关系。利用集落形成实验，迁移/侵袭实验、划痕实验评价升高 miR-101 后 对肝癌细胞迁移及增殖能力的抑制作用。结果：升高 miR-101 可以降低 EZH2 的表达 水平，而 EZH2 的表达升高可以抑制 miR-101 的表达。miR-101 前体诱导实验发现， 成熟 miR-101 只能诱导 pre-mir-101-1 的表达而对 pre-mir-101-2 的诱导作用不明显。 HepG2 与 SMMC-7721 细胞中， miR-101 前体诱导效率的不同，与细胞中 miR-101 位点缺失程度有关。升高 miR-101 可以明显抑制肝癌细胞迁移及增殖能力。结论：在 肝癌细胞中，miR-101 与 EZH2 是以双向负反馈环路的形式进行相互调控的。干预这 一环路对肝癌有抑制作用。 关键词: EZH2; miR-101; 反馈环路; 肝细胞癌 第二部分 利用双向电泳检测 miRNA 调控靶点的技术建构 目的：构建可用于 miRNA 靶点发现的双向电泳体系。方法：利用慢病毒过表达载体， 构建稳定表达 miR-101 的肝癌细胞系。通过双向电泳技术，分析过表达 miR-101 细胞 系与空载体细胞系蛋白质谱的变化，从而实现 miR-101 调控靶点的鉴定。结果：利用 24 ㎝ pH3~10 非线性固相 pH 梯度干胶条，在 10% 的 PAGE 胶上可以分离到 600 个 左右的蛋白质点，组内重复性较好，蛋白点匹配率达到 99%以上。组间差异较大的蛋 白质点 20 个左右。 结论：利用双向电泳技术，可以同时发现诸多 microRNA 调控靶 点。这为 microRNA 调控网络的研究提供了一个新的思路。 关键词: miRNA; 双向电泳; 肝细胞癌; 盐度控制 第三部分 miR-101 调控靶点的质谱鉴定与分析 目的：利用高效色谱串联质谱技术鉴定 miR-101 的下游调控靶点。 方法：手工切取 15 个差异明显的蛋白质点，进行色谱分离与进行质谱鉴定。利用生物信息学技术，分 析差异蛋白间的联系与功能。结果：15 个差异点全部鉴定成功。差异蛋白有着明显 的富集趋势。第一群，RNA 结合蛋白；第二群，miR-200 家族的相关靶蛋白；第三群， miR-101 的相关靶蛋白。结论：质谱鉴定结果显示，上调 miR-101 对肝癌细胞的蛋白 谱产生了广泛影响。下游调控点之间有着密切的联系。 关键词: miR-101; 调控网