基于酶扩增合成铜纳米颗粒及其在生物传感上应用-synthesis of copper nanoparticles based on enzyme amplification and its application in biosensing.docxVIP

湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□√。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日摘要纳米技术的提出为纳米材料科学的发展及应用开辟了新的领域。现代科学研究中，纳米技术结合物理、化学、生物和医学成像和超灵敏检测的方法在分析化学和生命科学中的地位越来越重要，是一个极具前景的领域。由于粒径微小（1-100nm）,金属纳米材料在化学、物理和电子性质非常独特，可用作构建新型的传感设备，特别在生化传感和电化学传感等方面。金属纳米材料的运用可以降低检测限，提高传感器的灵敏性，开拓一些已有材料不能完成的新的工作。近年来，以DNA为模板来合成铜纳米颗粒（DNA-CuNPs）在生物成像及传感应用中引起了越来越多研究者的广泛关注。因为其具有细微的尺寸，低毒性和很好的生物相容性的优势，相比于现已存在的荧光金属纳米粒子，以DNA为模板合成的铜纳米颗粒是一种新型的功能化生物化学探针。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），是一种特别的DNA聚合酶，它通过在DNA引物的3′-OH端不断添加碱基，催化无模板的DNA发生聚合反应。TdT广泛用作分子生物工具，用来标记DNA末端。本文基于TdT的扩增反应，提出了一种合成DNA-CuNPs的新型方法，并应用于酶的活性检测和分析。具体如下：1、利用TdT催化单链DNA（ssDNA）聚合反应的性质，开发出了一种新型的DNA-CuNPs合成方法。在一条原本不能合成CuNPs的DNA3′-OH端通过TdT催化发生聚合反应，从而在该DNA引物3′-OH端不断添加碱基，得到一段聚合胸腺嘧啶（polyT）的DNA序列，然后以这段polyT为模板合成能够发射荧光的DNA-CuNPs。此外，我们优化了TdT扩增反应的条件，以及可能会影响合成DNA-CuNPs的因素。并且比较分别以DNA-P-polyT和T40为DNA模板合成DNA-CuNPs，发现以DNA-P-polyT为模板合成的DNA-CuNPs发射出更高的荧光强度。同时，我们通过透射电子显微镜（TEM）来表征DNA-CuNPs。根据TEM图，我们分析以长链为模板合成的DNA-CuNPs荧光强度更大的原因是：1)长链DNA序列可以移除CuNPs表面极性溶剂，从而更好的保护CuNPs；2)荧光共振能量转移（FRET）的现象可能存在于CuNPs之间。2、基于新型DNA-CuNPs合成方法的构建，我们提出了一种TdT的活性分析检测方法。该方法实现了对TdT进行无标记、低背景、高灵敏地“turn-on”酶活分析，检测限为3.75U/mL。此外，该方法具有较稳定的重复性，在复杂生物环境中的添加回收取得了较满意的结果。接着，我们考察了TdT抑制剂焦磷酸钠对TdT的抑制效果。3、基于TdT对随机DNA底物扩增及新型DNA-CuNPs的合成，我们构建了一个酶活检测的通用性平台。我们选取限制性内切酶（BamHI）和碱性磷酸酶(ALP)作为目标分析物。实验得到，BamHI的检测限为0.005U/mL，信背比为31.4，跟相关文献报道的相仿；ALP的检测限为0.052×10-3U/mL，信背比为44.6，比相关文献报道较低。由于酶对底物具有特异性，所以BamHI和ALP的选择性都很好。此外，只需要换成不同的酶对应的DNA底物，就可以应用于核酸外切酶、切刻内切酶、DNA连接酶的活性分析。4、基于核酸内切酶V(EndonucleaseV)可以识别并切割脱氨基损伤以及切刻内切酶Nt.BbvCI特异性识别并切割含有其识别序列的DNA，我们把前面提出的新型DNA-CuNPs合成方法用于EndonucleaseV的“turn-on”放大检测。通过合理地设计三条DNA探针─一条含脱氧次黄嘌呤核苷的探针（Sub-DNA），一条与（Sub-DNA）互补的探针（Com-DNA），一条含有切刻内切酶Nt.BbvCI的酶切位点并与Sub-DNA部分互补的探针（Amp-DNA），我们成功实现了对EndonucleaseV的高灵敏度放大检测。另外，由于EndoV特异性识