高级生物化学--实验报告.docxVIP

??小鼠GAPDH基因的克隆、表达?与鉴定学号学生姓名指导教师2016年4月12日摘要甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3·phosphate dehydrogenase，GAPDH)是一种分布在细胞质中、在糖酵解过程中起关键作用的酶。但是近年来，越来越多的研究表明GAPDH是一种多功能蛋白，参与tRNA出核、mRNA稳定性调节、DNA损伤修复、组蛋白转录调控、凋亡及神经退行性疾病发生等。在细胞质和生物膜上也有重要作用。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作GAPDH基因，采用Trizol法从小鼠肝脏组织中提取总 RNA，并运用 RT-PCR 方法克隆了 GAPDH基因，连接到pET28a载体上, 并导入感受态的DH5α与BL21菌中筛选鉴定。选取鉴定正确的转化BL21克隆诱导表达GAPDH蛋白质，用SDS和Western Blot 鉴定。关键词: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)；基因表达; 载体；RT- PCR。绪论甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3·phosphate dehydrogenase，GAPDH)是参与糖酵解的一种关键酶，催化3-磷酸甘油醛转变为l，3．二磷酸甘油醛，同时以NAD+为受氢体生成NADH。由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。近年来，研究发现GAPDH在细胞质、细胞核及细胞膜上均有定位，其表达量在转录及转录后水平受到调节，mRNA水平和蛋白水平会随着各种刺激而变化。此外，还发现GAPDH在酵解功能以外还有多种功能，如在tRNA出核、mRNA稳定性、DNA损伤修复、组蛋白表达、TNF．a核酶活性、凋亡及年龄相关神经退行性疾病、微管聚合、小分子物质相互作用、细胞保护、膜融合和膜转运等方面均有调节作用[1]。刘志华等应用酵母表达技术研究 GAPDH 功能的研究也发现GAPDH 基因还具有抵抗逆境胁迫的功能。当活细胞处在各种环境压力的条件下，例如高温、高盐、低温等胁迫，其基因表达模式将发生改变，证明该基因具有抗盐、碱和高温胁迫功能，是一种重要的抗逆境胁迫基因 [2]。此次，我们用 RT-PCR方法克隆GAPDH基因，并重组到表达载体上进行了初步表达及表达产物的活性测定,为用基因工程菌生产GAPDH奠定基础。材料1.1试剂、仪器及实验用具1.1.1仪器台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床（不需加水），制冰机，超净工作台，微波炉和电磁炉，电泳仪和电泳槽，恒温水浴锅，紫外分光光度计，PCR仪，通风橱，恒温细菌培养箱，凝胶成像仪，高压蒸汽灭菌锅，电泳转移仪，脱色摇床，瞬时离心机。1.1.2实验用具剪刀,镊子,匀浆器 ,研钵（去除RNA酶），无RNA酶的eppendrof管，超净工作台，酒精灯，双面微量离心管架，试管架，记号笔,手表，摇菌试管，1.5mL离心管，0.5mL微量离心管，枪头（0～10uL，20～200uL，200～1000uL），100mL三角瓶，试管，1L量杯，1L定容瓶，涂布棒，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管，泡沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块,?垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子，电泳转移槽及转移夹，海绵块，滤纸，PVDF膜。1.1.3试剂LB 培养基，Kan青霉素储存液，无菌ddwater， 100mg/mL（M/V）IPTG，1.0mol/L TrisHCl（pH8.8）， 0.5mol/L TrisHCl（ pH6.8），SDS，Bis， Aps，2×上样缓冲液，TEMED ，考马斯亮蓝染色液， 5 X电泳缓冲液，20%（M/V）IPTG，50 X TAE电泳缓冲液，溴化乙锭储存液，10×加样缓冲液，6×加样缓冲液，电泳级琼脂糖粉，Taq DNA 聚合酶，10×PCR 缓冲液（MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP混合液， 10mg/mL RNase A，TE缓冲液，95%和 70%乙醇，Xho I, ApaI和BamH I 限制性内切酶，10×内切酶缓冲液，0.1 mol/L CaCl2溶液，T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液。DEPC水，75%乙醇(DEPC 处理的水配制)，异丙醇,乙醇,氯仿，Takara PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis Kit试剂盒(TAKARA