漓院pcr 教学 讲义.pptVIP

1.以细胞为基础的载体法;;P161;1.PCR反应的过程：;2.PCR反应体系：;2. 引物/ Primers;微生物多样性分析（16s rDNA） 病原微生物检测（H1N1病毒H基因） 食品中是否含转基因成分（针对其中的转基因植物成分） 动物生物多样性（mtDNA中的Cytb、COI、COII） 食品中病原体检测（沙门氏菌、LM等）;三、PCR扩增产物的分析 　　 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。; 1. 凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 (图.) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 分子杂交 是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。 3. 序列分析;四、PCR 延伸技术; 1、反向PCR： Inverse?PCR。主要用于解决扩增与已知序列相邻的未知DNA片段。原理：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板?DNA?，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。 克隆已知DNA片段周边的未知片段，即染色体步查.;2、RT-PCR：反转录PCR，其模板为RNA包括mRNA、 tRNA、rRNA和病毒RNA。 Reverse?transcriptase?PCR，即以反转录的?cDNA?作模板所进行的?PCR?反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆?mRNA?的?5?和?3?末端序列，从非常少量的?mRNA?样品构建大容量的?cDNA?文库。 用逆转录酶将RNA反转录为cDNA； 以cDNA为模板进行PCR。　　;3 RAPD / 随机扩增多态DNA; RAPD以PCR为基础，核心是DNA片段的扩增，与常规PCR不同在于引物。常规PCR需要一对引物，每个引物分子15～30nt，引物顺序根据待扩增的基因两端的顺序设计，因此要进行PCR时，必需知道待扩增基因的顺序。而RAPD分析时，只需要一个引物，长度为10nt左右，引物顺序时随机的，因而可在被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。 ; 单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来实现的。在基因组DNA分子内可能会存在或长或短被间隔开的颠倒重复序列，那么在两条单链上就各有一个引物结合的部位，构成单引物PCR扩增的模板分子。如果引物的核苷酸序列很短，退火温度又较低，引物与模板颠倒重复序列的结合机会就会增多，产生若干单引物PCR扩增产物，形成该引物的特异图谱。不同DNA中这种颠倒重复序列数目及间隔的长短不同，扩增的条带就不同，即出现多态性。 ;图 罗汉果暴鹏品种DNA用引物S90的 RAPD扩增结果 1到8表示暴鹏的8个不同的植株 ;RAPD 分子标记 ; AFLP（Amplified?fragment?length?polymorphism）是在RAPD和RFLP技术上发展起来的DNA?多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。 同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。; AFLP的基本原理是：以PCR为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3′端有3个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3′端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR 产物分离分开这些扩增产物，从而产生 DNA 指纹，用荧光法或银染染色法均可检测之。 ;AFLP 分子标记 ; 5 SSR标记/简单重复序列标记 又称微卫星DNA多态性，即由二核苷酸、三核苷酸或四核甘酸串联重复的拷贝数目不等而出现的多态性。 根据每个SSR（simple sequence repeat）两侧一般是相对保守的单拷贝序列， 依此设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的带型，就可检测到不同个体在某