第6章 目的基因的分离克隆(植物基因工程).pptVIP

◆从基因库中筛选、分离基因，可根据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。 ◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。 （1）基于基因文库的基因克隆 菌落杂交技术寻找目标DNA克隆 文库的抗体筛选 （2）T-DNA标签克隆基因 基本原理： 利用T-DNA插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料； 然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列； 用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析 。 T-DNA 载体构建 ↓转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 ↓筛选T2，获突变子，应为3:1分离 ↓确定T-DNA与突变型共分离的个体 ↓产生纯合后代 ↓克隆T-DNA两侧的植物DNA ↓利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 ↓基因功能的验证 （3）图位克隆 又叫 (或候选基因克隆) ,是根据目的基因的位置特性而非其编码产物来克隆。成功分离目的基因须具备三个必要条件： 分子标记 高密度遗传图谱 染色体步移法分离目的基因 高密度遗传学图谱 4、 PCR克隆 基于PCR的DNA克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。 PCR反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间。 PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的DNA。 对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的DNA样品，PCR扩增仍可获得目的基因克隆 （1）套式PCR （2）反向PCR （3）不对称PCR （4）锚定PCR （5）长程PCR （6）反转录PCR （7）锅柄PCR Bt886Cry3Aa基因的克隆 F-2k：5 ATG ATA AGA AAG GGA GGA AGA 3 R-2k：5 TTA ATT CAC TGG AAT AAA TTC 3 质粒提取 基因扩增 序列分析 5、 人工合成基因 ◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 寡核苷酸连接法 5、 人工合成基因 ◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)扩增出完整的基因片段。 限制化学法合成基因的因素 已知序列且有应用价值的基因很少，而植物来源 的基因更少； 化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装 才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备 难度加大； 化学基因合成相比之下比较昂贵。 植物转化 培养基 卡那霉素 亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合 成引物的 3′ 端向 5′ 端合成的，相邻的核苷酸通过 3′→5′ 磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去 其 5′ - 羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5′ - 羟基；第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保 护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3′ 端被活化， 5′ - 羟基仍然被 DMT 保护， 与溶液中游离的 5′ - 羟基发生缩合反应。 第三步， 带帽 (capping) 反应， 缩合反应中可能有极少数 5′ - 羟基没有参加反应 ( 少于 2%) ，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后 继续发生反应， 这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下， 亚磷酰形 式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤， 一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5′ - 羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程 中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在 CPG 上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物，成 品引物用 C18 浓缩 , 脱盐，沉淀。沉淀后的引