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激光共聚焦扫描显微镜有什么特点？ 1光源：用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。 2共聚焦技术：在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住。 3点扫描技术：共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。也就是通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z Z 轴重叠就可形成一个完整的三维图象 普通光镜：是在可见光源下一次性成像。 4信号放大、电子图像：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。 5软件：计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。 优势：在结构方面：激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高，可实现分层扫描，可实现连续扫描，可动态记录变化，可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像，扫描速度快，对样品损伤小。 在效果方面：更灵敏：共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确：不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。 定量测量。静态的定量测量：对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。动态的定量测量：共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、 钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。 快速性：由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。 数据图像可及时输出或长期储存：用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭???）；而且图像可进一步加工处理。 与静态细胞观察相比，活细胞观察有哪些优势？ 活细胞动态观察静态成像科研角度能够连续观察细胞及分子水平的动态变化，阐明机制，更能说明问题需要大量样品、时间点，样品的差异化问题，出现假阳性结果应用范围既能满足高分辨，又能够满足实践分辨要求较高的实验无法做时间分辨比较高的实验，以及对细胞或分子实时动态三维观察实验过程实验简单化，操作步骤少，数据信息充足实验设计复杂，步骤多，数据信息少 绿色荧光蛋白如何发出绿色荧光？ 水母体中有一种发光蛋白Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收从而发出绿色荧光，这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质就是GFP。GFP生色团： Ser 65- - Tyr 66- - Gly 67，GFP中丝氨酸65展开多肽骨架 环化 形成咪唑啉酮环系统形成 通过脱氢反应-H2O 形成 环化环系统 在经过 氧化反应+O2 形成成熟绿色荧光发色基团，发绿色荧光。 荧光的发光是被一定波长光激发后，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光，这也就是上面提到的受激辐射。我们将能接受光辐射，???跃迁发出颜色光的基团叫做生色团。绿色荧光蛋白含有一个三肽的单位Ser（65）-Tyr（66）-Gly（67），在蛋白质折叠的时候，这三个氨基酸会折叠成5元环的咪唑酮的结构，也就是生色团。当它被激发后，失去一个质子，形成了带负电荷的结构，在这种构象下就可以发光了。 与传统的荧光素相比，绿色荧光蛋白应用于蛋白质的荧光标记时有哪些优缺点？ 与荧光素酶相比，绿色荧光蛋白作为报告基因有哪些优缺点？ 举例说明绿色荧光蛋白可以应用于哪些方面？ 报告基因：可以监控细胞内活动；可以进行细胞筛选（FACS）：例如，可以在胚胎或成体复杂的组织中分离得到表达荧光蛋白的活细胞，通过荧光激活细胞分选，我们可以通过解剖分离含有目的的荧光蛋白的组织，然后酶消化成单个细胞，流式分选出表达目的的荧光蛋白的活细胞；还可用作蛋白质定位，如果蛋白质进入则颜色会叠加；可用来观测基因的表达水平。 转基因动物：主要是GFP在肿瘤研究中的应用，例如可以通过荧光的强弱判断肿瘤的大小与深度，内部的肿瘤所发出的荧光由于受周围组织，尤其是皮肤的干扰，小的瘤灶常难以显示，因此我们可以在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣，观察时打开皮瓣，建立荧光通路。 传感器：检测细内PH，绿色荧光蛋白可以激活FP，转换FP，开关FP。光漂白恢复：光漂白（ photo bleaching ）指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光