(色谱分析)聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE教材课程.pptVIP

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量; 概述;实验原理;; 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系，符合下列方程：;注意事项;4.多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚 基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋 白酶）组成的， SDS测定的只是它们的亚基或 单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。 5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白 质都能用SDS测定其分子量。包括：电荷异常或 构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些 糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。 6.对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。 ;SDS分类;实验过程;实验步骤;试剂名称;2.分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速 聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 3.浓缩胶的制备 用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。 ;二、样品处理与加样 1.样品处理 2.加样 小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用 微量进样器点样 三、电泳 接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。 ; 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。;流程图;结果分析; 2.标准曲线的绘制;3.未知蛋白质样品分子量的测算;在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。;Native和SDS的比较 ;4.非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，而SDS中所有蛋白都朝正极泳动。 5.在非变性凝胶电泳中，电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性。这点跟变性电泳也不一样。 所以与SDS电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率。