二试验前配置的workingsolution.PPT

Detection of ROS Introduction 盡可能避光 H2DCFDA Intracellular Esterase Oxidized by ROS 黃綠螢光 Detect by Flow cytometer ROS DETECTION PRINCIPLE 1.刺激時間終了後 此盤刺激過的細胞不做任何變動 並加入約50uM/ml（1mM stock solution加100μl至各well）的H2DCF-DA 在37℃反應30min。 2. 把上清的medium移到15ml離心管 。 3. 使用2ml PBS wash細胞然後把PBS移到步驟2的離心管。 4. 再加入2ml PBS並在室溫反應10min。 5. 將此PBS移到步驟2。 6. 加入0.5ml trypsin在37℃反應 5 min。 7. 然後使用步驟2的離心管內的PBS+Medium的混合液沖洗細胞並移到步驟2。 8. 以2000 rpm 離心 5min。 9. 倒去上清液,再加入2 ml PBS並mix細胞，使細胞打散。 10. 再以2000 rpm離心5min。 11. 倒去上清液,然後再加入1 ml Flow cytometer專用的PBS 並混 合均勻。 12. 將步驟11移動到Flow cytometer專用的試管 13.上機分析上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。 實驗步驟 NRK CON CON+DCFH CON+DCFH 植物萃取物A + DCFH 第1組 實驗組別規劃 植物萃取物A + DCFH 植物萃取物A + DCFH 植物萃取物A對纖維母細胞氧化壓力的影響 NRK CON CON+DCFH CON+DCFH 第2組 植物萃取物B + DCFH 植物萃取物B + DCFH 植物萃取物B + DCFH 植物萃取物B對纖維母細胞氧化壓力的影響 NRK CON CON+DCFH CON+DCFH pCMV-BMP2 +DCFH 第3組 BMP-2基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響 pCMV-BMP2 +DCFH pCMV-BMP2 +DCFH M13 CON CON+DCFH BSA+DCFH H2O2+DCFH BSA+DCFH H2O2 第4組(只做上面一排) H2O2與白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響 MDCK CON CON+DCFH Mannitol+ DCFH CON+DCFH Mannitol+ DCFH CON 第5組 高滲透壓對遠端腎小管細胞氧化壓力的影響 M13 CON CON+DCFH BSA+DCFH H2O2+DCFH BSA+DCFH H2O2 第6組(只做下面一排) 高H2O2或白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響 預期結果 Control DCFH Treatment +DCFH (增加ROS) (不增加ROS) * * 課程名稱: 進階實驗課程B—細胞科技實驗????????????? 學分數:1學分(實驗) 負責教師: 黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲???????????????? ??????? 授課時間:96/08/04, 05, 11, 12 教室:尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室 ????????????????????????????????????? ???? 主題： 細胞轉染技術與分析 運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡 PART II 96 well(一 , 二組) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B P NRK CON NF-kB NRK CON C-Myc NRK BMP2 NF-kB NRK BMP2 C-Myc BMP: 1ug C D E F P NRK CON NF-kB NRK CON C-Myc NRK BMP2 NF-kB NRK BMP2 C-Myc BMP:2ug G H 96 well(三 , 四組) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B P NRK CON NF-kB NRK CON C-Myc NRK BMP2 NF-kB NRK BMP2 C-Myc BMP: 4ug C D E F P M13 CON NF-kB M13 CON C-Myc M13 BMP2 NF-kB M13 BMP2 C-Myc BMP: 1ug G H 96 well(五 , 六組) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B P M13 CON NF-kB M13 CON C-Myc M13 BMP2 NF-kB M13 BMP2 C-Myc BMP:2ug C D E F P M13 CON NF-kB M13 CON