微生物限度检查方法再确认方案设计---副本.docVIP

微生物限度 检查方法验证方案 ***制药有限公司 验证方案审批表 审批 程序 部 门 负责人签名 日 期 备 注 起 草 批 准 质量部 设备部 验证委员会主任 备 注 1. 验证的目的及范围 1.1目的 为保证微生物检测方法的准确可靠，制定本验证方案，以确认所采用的检查方 法适合于原料药车间生产的的微生物限度检查。 1.2本次验证的范围 适用于的微生物限度检查方法的验证实施。 2概述 根据2015年药典标准，通过验证采用合适的方法进行的微生物限度检查。所使用培养基已进行适用性检查。 3合格标准 《中国药典》2015年版规定，试验组的菌数回收率均应在0.5~2范围内，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；控制菌试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若验证结果达不到规定，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 4试验准备工作 4.1验证环境要求：验证应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内进行。 4.2验证所用仪器 附表：所用仪器表 仪器名称 型号 仪器编号 供应商 双人净化工作台 生物安全柜 立式压力灭菌器 电热恒温干燥箱 电热恒温培养箱 恒温水浴锅 生化培养箱 架盘天平 4.3验证用培养基 胰酪大豆琼脂培养基 胰酪大豆液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 4.4验证用菌种名称及其编号 表4：所用菌种 菌种名称 代号 代数 来源 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 3 食品药品检定所 枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 3 食品药品检定所 铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104 3 食品药品检定所 白色念珠菌 CMCC(F)98001 3 食品药品检定所 黑曲霉菌 CMCC(F)98003 3 食品药品检定所 大肠埃希菌 CMCC(B)44102 3 食品药品检定所 5验证内容 5.1操作方法 操作方法可按《中国药典》2015年版四部“微生物限度检查法”中的平皿法。 5.1.1菌液的制备： 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌用胰酪大豆液体培养基，30-35℃培养18-24小时，白色念珠菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基，20-25℃培养2-3天，黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，20-25℃培养5-7天。 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液，按1:10的比例稀释制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3?5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，按1:10的比例稀释，制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃,在24小时内使用。 5.2 供试液制备 取供试品10g，加 H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使其完全溶解，摇匀，10mol/L NaOH溶液调节pH至6-8，作为1:10供试液，备用。 5.3 试验组： 取1:10的供试液1ml和1ml（不大于100cfu）试验菌液，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 5.4 菌液对照组： 取稀释液1ml和1ml试验菌液（不大于100cfu），注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 5.5 供试品对照组： 取供试液1ml, 注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 5.6结果判断 试验组平均菌落数减去供试品对照组平均菌落数的差与菌液组平均菌落数的比值应在0.5~2范围内 5.7控制菌检查方法的验证 5.7.1实验原料： 5.7.2验证用培养基 （1）麦康凯液体培养基 （2）胰酪大豆液体培养基 （3）麦康凯琼脂培养基 5.7.3验证用控制微生物名称及其编号：大肠埃希菌 [CMCC(B)44102] 5.8操作方法 操作方法可按《中国药典》2015年版四部 “微生物限度检查法”中控制菌检