培养细胞计数法.docVIP

培养细胞计数法: 细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数量。一般以细胞数/毫升表示。 用品：细胞悬液 培养液 计数板 程序 1用酒精冲洗计数板后 擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧， 以便滴加细胞悬液. 2取一吸管伸入培养瓶，轻轻吸打细胞悬液混匀。 3从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中 注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。 4镜下观察计数 计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算 左侧和上方的,右和下的不计算在内。 按下式计算： 细胞数/毫升源液= 镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算 如细胞团占10%以上,说明消化不充分,或细胞数少于200个/10平方毫米 或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当.需重新置备细胞悬液, 再计算。 培养细胞的冻存 在培养液中添加保护剂，如二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSO） 甘油,可使细胞免受低温冰晶形成及渗透压改变而导致的物理损伤， 培养细胞可长期保存于液氮（-190摄氏度）中。 用品 细胞冻存管 保护剂（甘油或二甲亚砜） 培养液，血清，液氮罐 步骤 培养细胞从增殖期到形成致密单层以前的细胞都可用于冷存， 最好是处于对数生长期（即繁殖期）的细胞 按比例混合培养液 血清（一般20%）冻存液（10-20%）制成冻存缓冲液,到出培养液， 消化细胞。由于细胞浓度低时失活较显著,因此需将细胞浓度调到 为易，取1-2ml加入冻存管，做好标记。一般而言,细胞 以1-10摄氏度/分的速度下降冻结为宜,在没有程序控制冻存器设备的 条件下,可先将冻存液细胞置于4摄氏度冰箱4h,然后移入液氮容器的气 相液氮中1h,速侵入液相液氮（-190摄氏度）中.能获得较好的复苏率。 细胞的复苏 冻存细胞的复苏以急速融化为原则，使培养物能快速通过 对细胞有损害的-50~0摄氏度区域。 培养细胞计数法: 细胞的复苏步骤 从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有38摄氏度温水的容器内，摇动冻 存管,使其内容物在20-60秒内完全融化成悬液。无菌下打开冻存管， 接种于培养瓶中，加入新鲜培养液，37摄氏度孵箱培养24 h更换 培养液去除冻存液，继续培养。 13 细胞冻存管，保护剂，培养液，血清，液氮罐，逐一弹出 14 取培养细胞-倾倒培养液-加胰酶消化-计数-配置冻存液-加入冻 存管放入4摄氏度冰箱-液氮瓶口（气相）。 15 从液氮取出冻存管-投入水容器-于超净台内打开-接种于培养瓶 -放入孵箱中。。 细胞运输 当前培养细胞既在国内进行寄憎，交换和购买，也在国际交流， 为此需要装运细胞的方法。一种是用液氮或干冰贮存运输， 需要特殊容器，较麻烦，且不适于长时间运行， 另一方法为充液法，方便当行，是当前多采用的方法 具体方法： 1选生长状态良好的细胞，待培养近单层后，去掉培养液充满新培养液。 液量要达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。 空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。 一般经4~5天运输对细胞活力无大影响。时间过长，细胞活力下降。 2到达后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液体量。 置37摄氏度培养，次日传代。 ?