生物技术制药第3章.pptx

本章主要内容;第一节 概述;应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题。它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。 ;基因工程是利用DNA重组技术在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生人类需要的基因产物，达到定向地改变生物遗传特性或创造新物种的目的。;利用基因工程技术生产药物的优点： ;3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除； 5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 ;第二节 基因工程药物生产的基本过程;基因工程的主要操作步骤;基因工程药物制造的主要程序;通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。 上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因，构建工程菌，在实验室完成。 下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。;下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。;第三节 目的基因的获得;内含子是基因内的间隔序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有内含子。需注意的是，在古细菌中也有内含子。 　　在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。术语内含子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。 　　大多数真核结构基因中的间插序列（intervening sequence）或不编码序列。它们可以转录，但在基因转录后，由这些间插序列转录的部分（也可用内含子这个术语表示）经加工被从初级转录本中准确除去，才产生有功能的RNA。基因的编码部分称外显子。内含子常比外显子长，且占基因的更大比例。真核基因所含内含子的数目、位置和长度不尽相同，如鸡卵清蛋白基因的外显子被7个内含子隔开，鸡卵伴清蛋白基因有17个内含子，α-珠蛋白基因有2个内含子，卵粘蛋白基因有6个内含子等。 　　又称沉默DNA（silent DNA）。真核基因中的非翻译区，它不被表达于蛋白质分子或成熟的mRNA中。内含子把单个真核基因分成许多不连续的区域。内含子也可见于某些前核基因组，但较为少见，且也有许多调节功能。由核RNA转录产生的为不均一核RNA(hnRNA)含有内含子，经特殊的酶（如ribozyme）作用切去内含子序列，然后剩余的外显子（exon）被连接酶拼接成为成熟的mRNA。;内含子和外显子;;克隆真核基因常用的方法有： 逆转录法 化学合成法;一、逆转录法;互补DNA克隆示意图;1、mRNA的纯化;2、互补DNA第一链的合成;3、互补DNA第二条链的合成;4、互补DNA克隆;PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的新方法: 高温变性:即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 低温退火:在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链； 适温延伸:在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。 ;5、重组体导入宿主细胞 λ噬菌体感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑 6、cDNA文库的鉴定 根据重组体的表现进行筛选 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 核酸探针杂交法；免疫反应鉴定法;二、化学合成法;用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 ;人工化学合成的限制 ;翻译-密码子;第四节 基因表达;一、宿主细胞的选择 二、大肠杆菌中的基因表达 三、酵母中的基因表达;一、宿主细胞的选择;宿主可分为两大类 ;1、原核细胞;大肠杆菌作宿主的缺陷;（2）、枯草芽孢杆菌;（3）、链霉菌;2、真核细胞;（2）、丝状真菌;（3）、哺乳动物细胞;综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源基因在这两种宿主菌中得到成功表达。;二、大肠杆菌中的基因表达;1、表达载体 根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：（1）、载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复