家蚕“明”死卵突变体l-em基因的定位克隆及功能研究-positional cloning and functional study of l - em gene of silkworm.docx

江苏科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： (1)保密□，在 年解密后适用本授权书。 (2)不保密□。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 年 月 日 摘 摘 要 I I 摘 要 家蚕是一种完全变态昆虫，以卵滞育，可以说卵是家蚕生命周期中的第一个 发育阶段，蚕卵品质的好坏直接影响到幼虫、蛹和成虫的发育。正常卵通常呈短 椭圆形、侧面扁平且有轻微凹陷。本课题研究对象“明”死卵突变体（lethal egg of “ming”, l-em）是在实用品种“苏·菊×明·虎”母本品系“明”的生产和保存过程中发现 的一种死卵突变体，在产卵后一小时左右出现三角形凹陷，表现失水死亡特征； 遗传分析发现该突变由一对隐性基因控制，纯合致死，遵循伪母性遗传规律；扫 描电镜观察突变体卵壳，发现卵壳表面凹陷处小室的边缘有明显的裂纹，卵壳纵 断面中间层亦出现不连续的裂缝。本研究在对 l-em 卵突变体遗传分析及表型观察 的基础上，采用图位克隆技术对 l-em 基因进行了定位克隆，采用 qRT-PCR、2-DE、 RNAi 等技术对候选基因进行表达分析和功能验证。主要研究结果如下： 一、l-em 基因的定位 选择 l-em 卵突变体隐性纯合的雄性亲本（P1）与 p50 近交系的雌性亲本（P2） 杂交，组配 F1 代群体；F1 代雌性个体与雄性亲本（P1）回交，同时进行蛾区内 自交分别组配 BC1F 群体及 F2 代群体。使用 P1、P2 和 F1 筛选了 28 个连锁群上具 有多态性的 SSR 分子标记，并使用 BC1F 群体确定了 l-em 基因位于家蚕第十连锁 群；进一步对 2287 个 F2 代群体中产死卵的雌性个体检测，使用 13 个与 l-em 基 因连锁的具有多态性的 SSR 标记，将 l-em 基因定位于 S65 与 S82 两个标记之间， 相距约 360 kb，绘制出 l-em 基因的分子标记遗传连锁图谱；通过与家蚕基因组比 对查明该区域内包含 24 个基因。 二、候选基因的表达模式、基因结构分析和功能验证 通过对 24 个基因在正常蛾及 l-em 卵突变体蛾卵巢内的表达分析，明确了 2 个差异表达基因 BmVMP23 和 BmEP80 为候选基因。BmVMP23 基因的表达量在 l-em 卵突变体的卵巢中出现明显下调，而在 l-em 卵突变体的卵巢中则未检测到 BmEP80 基因的表达。 反向 PCR 分析测序显示 BmVMP23 基因终止密码子后的第 22 个碱基至 BmEP80 基因 ORF 的第 161 个碱基间发生了突变，导致 BmVMP23 基因的 3′-UTR 和 BmEP80 基因结构的不完整性。 对 2 个候选基因的 RNAi 试验表明，经 BmEP80 基因干扰后的部分雌蛾所产 卵发生明显的凹陷，且表型与 l-em 卵突变体所产卵的表型相似，而对 BmVMP23 基因干扰未见此现象。因而推断 BmEP80 基因的突变是导致 l-em 卵突变体产生的 主要原因。 江苏科技大学农学博士学位论文 江苏科技大学农学博士学位论文 II II 三、l-em 突变体卵巢组织差异蛋白质分析 通过双向电泳技术对正常个体及 l-em 卵突变体的卵巢组织进行蛋白质组学 分析，结果显示 BmEP80 基因所编码的 BmEP80 蛋白从蛹期第九天开始在正常 个体卵巢中大量表达，而在 l-em 卵突变体的卵巢中则未检测到该蛋白的表达。除 了 BmEP80 蛋白之外的其他蛋白在正常个体和 l-em 卵突变体之间无明显差异。进 一步说明了 BmEP80 蛋白的缺失是 l-em 卵突变体产生的主要原因。 四、候选基因 BmVMP23 的表达调控分析 鉴于 l-em 卵突变体的 BmVMP23 基因的 3′-UTR 结构被破坏，而 3′-UTR 为 miRNAs 的调控位点，为了分析 miRNA 对 BmVMP23 基因的表达调控作用，将 BmVMP23 基因的 3′-UTR 序列与家蚕的 miRNAs 序列比对，发现了一个与 BmVMP23 基因的 3′-UTR 序列匹配度极高的 miRNA（bmo-miR-1a-3p）。荧光实 时定量检测该 miRNA 在正常个体卵巢中表达量较高，且其表达趋势与 BmVMP23 基因的表达趋势相反，而在 l-em 卵突变体卵巢中仅有微量表达。通过 miRNA mimic 过表达和 miRNA inhibitor 抑制表达