家蚕幼虫马氏管免疫相关基因的分析-analysis of immune related genes in malpighian tubules of silkworm larvae.docx

摘要家蚕是典型的鳞翅目模式昆虫，完全依赖于人类才能繁衍的重要经济昆虫，对于 家蚕马氏管免疫相关基因的研究，不仅能了解家蚕免疫应答的分子调控机制，也有助 于对其他昆虫的分子免疫调控机制的理解。模式昆虫果蝇的马氏管可作为自主免疫组 织，当机体受到微生物侵染时，能独立于脂肪体启动有效的免疫应答产生抗菌肽保护 机体免受微生物的侵染，我们以此为依据开展家蚕马氏管免疫相关功能基因的研究。 为了探讨家蚕幼虫马氏管的蛋白质组学及其免疫功能，本文借助蛋白双向电泳技 术（2-D）对感染 BmNPV 不同时相的家蚕幼虫马氏管蛋白进行分离，随后利用基质辅 助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）对其中 14 个差异蛋白点进行质谱分 析。结果表明： 10 个蛋白点得到成功鉴定 , 分别为 NADPH-specific isocitrate Dehydrogenase、泛醇-细胞色素 C 还原酶核心蛋白Ⅱ、蛋白二硫键异构酶、丙酮酸脱 氢酶 E1 复合物 β 亚基、天冬氨酸转氨酶、乙酰乙酰基辅酶 A 硫解酶、3-羟基异丁酸 脱氢酶、羟基丙酮酸异构酶/一氧化氮合酶、质子转移 ATP 合酶 β 亚基、ATP 合酶。 其中质子转移 ATP 合酶 β 亚基在马氏管内已见报道，本文对另一可信结果家蚕一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase ；简称 BmNOS）做进一步的研究。由于诱导型 BmNOS 是合成巨噬细胞免疫效应因子 NO 的一种关键特异性蛋白酶， 故本文通过体内注射 BmNPV 和 LPS 两种诱导剂，采用半定量和实时荧光定量 PCR 的方法，对感染组和对照组马氏管中 BmNOS 的不同感染时期的表达进行了定量分析。 结果表明：经两种诱导剂处理 3h 后，处理组 BmNOS 表达量均呈迅速递增，BmNPV 侵染组上调约 7 倍，LPS 处理组除 3h 表达量上调 25 倍外，该趋势持续到 6h 处理组仍 表现出明显的上调趋势，随后逐渐降低并趋于平稳的趋势，推测 BmNOS 在家蚕马氏 管的免疫中具有重要的功能。关键词 家蚕；内生免疫；双向电泳；马氏管；BmNOS；荧光定量 PCRABSTRACTThe silkworm, Bombyx mori, is a typical model system for Lepidoptera and is also an important economic insect, which should be reared by mankind. Research on the silkworm immune-related genes will help us understand not only the molecular mechanisms of silkworm immune respose, but also the diversity of insect immunity.Recently, Drosophila has revealed the Malpighian tubule (MT) plays a signification role in immunity; the MT are capable of sensing bacterial challenge, and mounting an effective killing response by secretion of antimicriobial peptides, entirely independent of the fat body, the canonical immune tissue. Based on the achievements from Drosophila MT, we start to investigate the immunity function of the MT in silkworm.In order to investigate the proteomics and immune function of the MT in silkworm, the proteins of MT, which infected with BmNPV-EGFP, were separated by using the method of the Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D). Fourteen protein spots that increased dramatically in the infected ones were excised and supplied to identify furt