家蚕质型多角体病毒bmcpv基因组片段7s7功能的研究-study on the function of 7s7 fragment of bmc pv genome in bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus.docx

中文摘要 家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组片段 7（S7）功能的研究 测到分子量约为 20 kDa 的蛋白条带，在感染 BmCPV 的中肠组织中也可检测到 25 kDa 和 20 kDa 的蛋白条带。说明 VP7 在病毒感染的细胞中被切割，但在感染的培 养细胞和感染的中肠组织中切割方式存在差异，VP7 在感染细胞与非感染细胞中 的切割方式也存在不同。用 VP7 抗体对 BmCPV 病毒粒子进行 Western blotting 检测，发现除可检测到 55 kDa 的特异性条带外，还能够检测到分子量约 38、25 和 10 kDa 大小的 3 个蛋 白条带，推测 BmCPV 病毒粒子中存在不同切割程度的 VP7。3. VP7 的亚细胞定位及 BmCPV 感染过程中 VP7 蛋白水平的变化分析 对感染 BmCPV 8d 的中肠后部进行组织免疫荧光检测发现，绿色荧光集中在细胞质中，表明 VP7 定位在细胞质。感染 BmCPV 1d～12d 后的中肠后部组织蛋白 定量后进行 Western blotting 检测，在感染 7d 的组织中，可检测到 20 kDa 左右的 蛋白条带；感染 8d 时，VP7 表达量增加，可检测到 55、25 和 20 kDa 蛋白；感 染 9d 时，VP7 表达量达到高峰，除可检测到 55 kDa 蛋白外，也可检测到 28、25、 20 和 18 kDa 蛋白条带；10、11 和 12d VP7 的表达与第 9d 相似，但多检测到 1 个 分子量约为 22 kDa 蛋白。推测 VP7 在病毒增殖的不同时期，其切割方式可能存在 细微差异。4. 抑制 vp7 基因表达对病毒增殖的影响为了进一步探究 vp7 基因表达对病毒增殖的影响，3 龄起家蚕注射 VP7-siRNA (1μg/头)，24h 后，人工感染 BmCPV，48h 后检测 vp7 和 vp1 的 RNA 水平，结果 显示 vp7 基因和 vp1 基因的相对表达水平分别下降了 5.2 倍和 15.4 倍； BmN 培养 细胞分别转染 3 种 VP7-siRNA 24h 后，人工感染 BmCPV，48h 后检测 vp7 和 vp1 的 RNA 水平，结果显示 vp7 基因相对表达量分别下调 17.5、9.7 和 4.7 倍，vp1 基 因的相对表达量分别下调 13.0、6.3 和 3.0 倍，表明抑制 vp7 基因表达，可抑制 BmCPV 病毒的增殖。5. VP7 相互作用宿主蛋白的筛选与鉴定为了研究 VP7 与宿主蛋白的相互作用，利用免疫共沉淀和质谱分析筛选鉴定 与 VP7 互作的候选宿主蛋白，共鉴定到 18 种与 VP7 互作的宿主蛋白；信息分家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组片段 7（S7）功能的研究中文摘要 析结果显示，这些蛋白涉及到糖代谢、胆固醇代谢、核苷酸降解、线粒体与细胞 质之间的阴离子转运、围食膜形成、免疫应答、转录调节、JH 结合、蛋白降解、 细胞周期与凋亡等各个方面。关键词：BmCPV；S7 片段；VP7；蛋白裂解；基因表达；细胞定位；功能分 析；相互作用作者：何蕾 指导老师：贡成良Molecular Function of Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus Genome Segment 7AbstrctBombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus (BmCPV) is one of the main pathogens, which can infect midgut cells of silkworm larvae and cause midgut polyhedrosis. Considerable economic loss was frequently occurred in sericulture because of midgut polyhedrosis. BmCPV genome consists of 10 dsRNA segments and segment 7 (S7) encoded structural protein VP7. In this study, subcellular localization, cleavage and expression phase of VP7 were detected by Western blotting analysis and immunohistochemistry with VP7 antibody. In addition, the effect of silencing vp7 gene on BmCPV proliferation was