乳酸杆菌讲解课件.ppt

第一部分 hCGβ抗原在乳酸杆菌的分泌性表达 第二部分 pH值对乳酸杆菌hCGβ表达的影响 在无选择压力下培养50代并经2次冻存、复苏后，上清中hCGβ浓度仍可达到 250 mIU/ml 红霉素耐药基因已自发缺失，可安全地应用于人体 更有效地裂解乳酸杆菌 较简便的电穿孔方法: 105转化子/ugDNA S层蛋白信号肽序列引导分泌 为用乳酸杆菌在阴道内表达功能蛋白奠定了基础 Lactobacillus casei CECT5267稳定、分泌、高效表达了hCGβ蛋白： 小结1： 表达hCG?的乳酸杆菌对BAL B/c小鼠阴道免疫及其免疫效果 * * 重组hCGβ乳酸杆菌对小鼠阴道粘膜免疫的效果 李大金 复旦大学妇产科研究所 避孕疫苗：安全、方便、不影响生殖内分泌 精子抗原、 hCG ? 、卵透明带、FSH Talwar, hCGβ-HSD疫苗 有效：50ng/ml hCG结合力 可逆： 35ng/ml, 内源性hCG无免疫原性 有效率：80-85% 原因：载体；免疫途径 系统免疫(1/10)、粘膜免疫 研究现状: 抗原 Dome T cell zone B cell zone Surface IgA+ B Activated B Resting B CD4+ T-na?ve CD4+ T activated CD4+ T memory CD8+ CTLs MALT 血液 归巢 粘膜效应部位： 胃肠道 上呼吸道 泌尿生殖道 腺体 M cell lympoepithelium 共同粘膜免疫机制 活疫苗载体在粘膜部位持续表达抗原 细菌/ 病毒减毒株：减毒沙门氏菌、Bordetella pertussis，呼吸道合孢病毒等 细菌/ 病毒减毒株有潜在致病能力 乳酸杆菌是人体正常菌群，具有GRAS(generally regarded as safe)特性 阴道、肠道常驻菌，拮抗致病菌 在粘膜局部定居并持续表达抗原 避免体细胞表达抗原时可能的基因突变 方便、易于接受 用乳酸杆菌在生殖道局部表达外源蛋白并刺激产生抗原特异性抗体 至今未见报道 乳酸杆菌表达抗原经粘膜免疫 可用乳酸杆菌表达多种细菌蛋白： 几丁质酶，噬菌体胞壁水解酶，果聚糖酶，超氧化物歧化酶 S-层蛋白表达信号 获得了240mg/L表达效率 膜锚定序列将目的蛋白锚定在胞膜上 从未表达过哺乳动物功能蛋白 乳酸杆菌基因工程的发展 G＋细菌 不存在周质空间，可直接从上清中获得分泌性表达的目的蛋白 优势 劣势 不易裂解，质粒抽提效率低 外源基因导入困难(不接受连接混合物；需大量纯化的质粒：电转一次，500ng) 无商品化的工具 乳酸杆菌基因工程的挑战： 整合型表达载体pIlac、表达菌Lb casei CECT5276 优点： 可在大肠杆菌中高拷贝的扩增，便于基因克隆；获得大量纯化质粒，使得转化方便 介导外源基因整合入宿主菌的基因组中，稳定表达；红霉素耐药基因可自发缺失，安全 TAAAAAGGAGGCTGCAGCATATGCCCGGGGAATTCAATCGGAGGGAATG RBS PstI NdeI SmaI EcoRI LacF LacG ori Ap Em pIlac 4895bp 基因组DNA 基因组DNA 基因组DNA 目的基因 目的基因 Ery Ery 目的基因 目的基因 pIlac pIlac 研究目的： 构建乳酸杆菌hCG ?稳定表达株 乳酸杆菌在小鼠阴道内表达hCG?抗原 经阴道免疫小鼠，以在生殖道局部刺激产生抗hCG?抗体 构建质粒pIlac-hCG ? 电穿孔转化乳酸杆菌 获得重组hCG ?乳酸杆菌稳定表达株 技术路线: PCR扩增670bp片段并测序 与hCG?基因连接 PCR扩增信号肽+ hCG? 将信号肽+ hCG?克隆入pIlac,得到 pIlac hCG? pIlac-hCG ?的构建: EcoRI KpnI 670bpS-层蛋白表达信号 pUC18 KpnI BamHI XbaI HindIII EcoRI/KpnI双酶切 pUC18A EcoRI KpnI PCR Lb DNA 连接 EcoRI S-层蛋白表达信号 扩增670bp的S-层蛋白表达信号 S-层蛋白表达信号序列测序及blast 结果 agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa gtaaagagatttctttaaacttgattgcataattt