阿尔巴斯白绒山羊诱导性多潜能干细胞生成的研究-动物学专业论文.docx

阿尔巴斯白绒山羊诱导性多潜能干细胞生成的研究邰大鹏 呈立体状生长，椭圆形、表面光滑、折光性强。第28d，经碱性磷酸酶(AP) 染色鉴定，约80％的克隆呈阳性。1．2 giPSCs的多能性检测 免疫荧光检测结果显示giPSCs表达OCT4、SOX2、NANOG、SSEA一1、．TRA．1．60和TRA．1—8 1等胚胎干细胞标志性蛋白，而不表达SSEA．3和SSEA． 4。RT-PCR结果显示giPSCs表达OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、 REXl等胚胎干细胞标记基因。giPSCs能在体外自分化形成具有三胚层分化 的类胚体，经免疫荧光检测具有外胚层标记蛋白Ⅲp—Tubulin、中胚层标记蛋 白Desmin和内胚层标记蛋白Cytokeratin的表达；giPSCs能在体内分化形成 畸胎瘤，经组织切片染色检测具有腺体样组织(内胚层)、肌肉组织(中胚层)和神经组织(外胚层)的分化。giPSCs具有正常核型，为58+xx。2 giPSCs诱导及培养条件的优化2．1转录因子的搭配和培养基的优化 转录因子组合OSMK(将Oct4、Sox2，Klf4、c—Myc组合至一个载体中)、Oct4+Sox2+Klf4+c一岣，c和Oct4+Sox2+Klf4都能诱导GFFs生成giPSCs。其 中OSMK病毒感染的细胞，每5×104个细胞中可获得22．8i2．9个AP阳性克 隆，克隆重编程成度高，不易分化，内源基因OCT4和NANOG高表达(P0．01)； Oct4+Sox2+Klf4+c．Myc病毒组感染的细胞，每5x 104个细胞中可得23．8士2．2 个AP阳性克隆，长期传代后高代克隆易分化，克隆中内源的Sox2基因高表 达(P0．叭)；Oct4+Sox2+Klf4病毒组感染的细胞，每5x104个细胞中只获得5．0+1．0个AP阳性克隆，克隆中内源基因OCT4、SOX2和NANOG的表达水 平低(PO．01)，克隆易分化。培养基中逐步添加小分子化合物Vc、VPA和 LiCl，统计每5x104个细胞中生成的giPSCs的ALP阳性克隆数发现，含有vc万方数据内蒙古大学博士学位论文 的培养基中可形成平均17．5+1．3个阳性克隆，与未添加小分子的培养基相比 干细胞标记基因OCT4、SOX2和NANOG的表达水平显著提高(P0．01)；含 有VPA+LiCl的培养基中可形成平均24．84-2．1个阳性克隆，OCT4和NANOG 基因的表达水平显著提高(P0．01)；含有Vc+Ⅵ)A+“Cl的培养基中可形成 平均28．9i-0．75个阳性克隆，与前两组相比干细胞标记基因OCT4、SOX2、NANOG的表达水平再次提高。结果表明培养基中渤日小分子化合物Vc、VPA和LiCl能有效提高重编程效率。 2．2饲养层和靶细胞的选择实验中分别选择了昆明白小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、绒山羊胎儿成纤 维细胞(GFF)、山羊胎儿成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细胞1：1混合 (MEF+GFF)细胞作为giPSCs的饲养层细胞。结果发现，giPSCs在MEF饲 养层上的生长增殖速度比较慢，细胞暗淡，折光性差，易分化，内源基因OCT4、 SOX2、NANOG的表达水平较低(P0．05)。相比于MEF饲养层，GFF饲养 层上培养的giPSCs克隆质量优，克隆光滑圆润，边缘清晰，细胞生长速度较快。内源基因OCT4、SOX2、NANOG的表达水平高(P0．05)。MEF-岷FF饲养层上的细胞克隆与小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养的细胞克隆相似。结 果表明同源的GFF饲养层更适合giPSCs的增殖生长。靶细胞的选择上，本 实验诱导阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)、肺问充质干细胞 (LMSCs)、骨髓间充干细胞(BMSCs)、初级毛乳头细胞(PHFDPCs)、次级毛乳 头细胞(SHFDPCs)以及成体成纤维细胞(GEFs)均能获得giPSCs。其中GFFs 的重编程效率最高，每5×104个细胞中可形成24．7±2．1个AP阳性克隆； 其次是PHFDPCs，每5×104个细胞中可形成20．8±1．7个AP阳性克隆，而万方数据阿尔巴斯白绒山羊诱导性多潜能干细胞生成的研究邰大鹏 相同条件下SHFDPCs中仅生成15．3±1．5个；两种问充质干细胞的重编程效 率低于GFFs和PHFDPCs，LMSCs每5×104个细胞中可形成17．4±1．2个 AP阳性克隆，BMSCs的为18．7±2．2个；成体成纤维细胞的重编程效率较 低，每5×104个细胞中只形成10．4±1．8个AP阳性克隆。证明PHFDPCs和 GFFs比较适合giPSCs的重编程。3 giPSCs的全基因表达谱分析3．1 giPSCs的表达差异基因的分析 全基因表达谱芯片分析giPSCs(GFF