第四章细胞原代培养.pptVIP

上节要点回顾 细胞培养用液主要包括哪些 血清的主要作用 血清细胞培养基 无血清细胞培养基 消化液 活力 PH调整液 本章重点： 了解并能掌握原代培养的过程。 自己设计某种细胞的原代培养并论证其的可行性。 一、原代培养的概念 1 定义： 从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养。 通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。 2 含义 ①初次培养，不更换培养物的生长器皿 ②原代培养中的“代”不是指细胞的“代”数，原代培养物中的细胞在接种之后，并不一定没有分裂增殖。 ③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液也不等于不更换培养器皿。 ④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需用要分割培养物为较小的部分再培养。 二、原代培养的过程 取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养箱中培养。 1 取材及培养材料的制备 （1）准备工作 主要是对所涉及的器具、用品的灭菌以及实验者、实验动物的清洁与消毒。 ①解剖器械和器具 ②工作台面 ③操作者 ④实验动物 （2）取材及培养材料的制备 ①取目的组织块，洗涤、去脂、被膜、以及坏死组织。 ②1mm3组织块放于培养液中植块培养。 ③剪碎加入胰蛋白酶消化液。 ④将制成的细胞悬液用（不锈钢网筛）过滤。 ⑤离心。 ⑥弃上清液，将细胞溶液用少量培养液重新悬浮为细胞悬液。 ⑦用血细胞计数板计数细胞密度。 ⑧培养液调至期望密度，准备接种。 （3）几种常用实验动物的取材 胚胎动物的取材：胚胎动物是体外培养常用的实验动物。由于胚胎生存于母体子宫内或者蛋壳内（鸟类），取材时主要注意对母体动物或者蛋壳进行消毒。 （38℃、40～70%湿度、21d）保存，4～10℃，10d a.将孵育一定时间的受精蛋取出，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。 b.受精蛋大头朝上，钝器击破，尽可能大些，去碎片，撕膜，暴露出尿囊绒毛膜后附着的血管。 c.用弯镊子撕破尿囊绒毛膜，然后轻轻夹住鸡胚的颈部，托出鸡胚。放到事先盛有培养液的培养皿内。备用。 鼠胚： 皮肤标本取材 通过手术进行取材，取材时75%乙醇消毒两次（不能用碘酒），然后进行表皮层与真皮层的分离，消化，分别培养。 2 分离（散）细胞的方法 取材后，若要进行分离（散）细胞培养，紧接着的一个工作就是将所有取得组织分离成细胞悬液，方法有多种。最常用的是机械解离细胞法，酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 Ⅰ机械细胞分离法： 主要适用于质地较软，内含纤维性成分较少，而且对机械分离较具耐受能力的组织，例如，胚胎组织，成年的脑组织、肝、肿瘤等。 抽吸法： 器材：细口径吸管、移液器、试管、培养瓶 步骤： ①洗涤 ②吸吹到组织块上至消散为止。 ③离心（1000r/m，5min） ④弃上清，重制细胞悬液，计数。 过网/筛法 机械解离细胞法的优缺点：所需时间短，原则上这种方法对于分化程度较高的细胞如成熟的神经细胞、肌肉细胞易造成伤害，细胞的存活率相对较低。使用时需根据不同细胞的耐受能力调整强度和时间。 Ⅱ消化分散法 采用低浓度胰蛋白酶或胶原酶对剪切成1mm3的组织块进行多次消化，使组织分散，细胞分离。配制时，一般使用不含Ca2+,Mg2+的平衡盐溶液或其它无Ca2+,Mg2+的缓冲溶液。 步骤（略）。 其它酶：链霉蛋白酶、透明质酸酶、粘蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及弹性蛋白酶等。 Ⅲ螯合剂解离法 螯合剂包括：EDTA-Na、柠檬酸钠、枸椽酸钠等。用无Ca2+,Mg2+的缓冲溶液配制，常与酶联用。 步骤（略） 3 细胞计数 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 4 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞较困难。 （1）细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。 克隆形成率＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠 (2) 台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力，已淘汰。 (3) 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还