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河南科技学院 第三章 酶的分离纯化 Extraction, Separation and Purification of Enzyme 第一节 酶纯化设计 一、基本原则 1、原则 了解目标蛋白及主要杂质性质 产品用途 分离纯化技术操作单元信息 2、酶纯度 3、酶活性保持 4、酶数量 二、过程优化 1、目标：收率、纯度最高，成本最低 2、必须解决两类问题 可替换操作选择 理想的色谱顺序 3、纯化方法 初级阶段：高处理量、低成本 后期阶段：分辨率 4、技术顺序 沉淀技术、离子交换、亲和色谱、凝胶过滤 最佳方案？ 三、酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 一、 酶样品分离 （一）细胞破碎 1、超声波法 2、高速珠磨法 3、高压匀浆 4、冻融法 5、渗透压冲击法 6、酶解法 溶菌酶、蜗牛酶 超声波细胞粉碎机 细胞破碎珠 高压细胞破碎机 电动玻璃匀浆机 第二节 酶样品预处理 第二节 酶样品预处理 一、 酶样品分离 （二） 蛋白质样品分离 1、聚沉和絮凝 2、离心 3、过滤 二、酶样品浓缩 1、吸附法 惰性多孔介质（Sephadex，Bio-Gel） 选择性差、不能连续操作、收率低（80%-90%） 第二节 酶样品预处理 二、酶样品浓缩 2、超滤 加压超滤 离心超滤 MWCO、样品、压力、离心力 第二节 酶样品预处理 二、酶样品浓缩 3、沉淀法 沉淀、清洗溶解 4、透析法 透析袋，20%聚乙二醇或干葡聚糖凝胶 5、冷冻干燥法 6、双水相法 三、酶样品沉淀 1、盐析法 分级沉淀 2、有机溶剂法 3、等电点沉淀法 4、聚乙二醇沉淀法 5、选择性沉淀法 不同温度，不同pH 四、酶样品透析 第三节 离子交换色谱（IEC） 一、离子交换剂类型 功能基团：强阳 强阴 弱阳 弱阴 1、离子交换树脂 孔径过小而交换容量小 电荷密度过高，蛋白结合牢固不易洗脱 常用于脱盐，小分子氨基酸和短肽分离 例外：聚丙烯酸树脂适合小分子碱性蛋白 一、离子交换剂类型 2、离子交换纤维素 表面积大，开放性骨架，允许大分子通过，交换容量大 亲水，结合 4 倍于自身重量水，和蛋白主要以离子键结合，其它作用力很低，便于洗脱 活性回收率高 Whatman：DEAE-，CM-，QA-，SE-系列 Pharmacia：DEAE-Sephacel Bio-Rad：Cellex- 一、离子交换剂类型 3、离子交换葡聚糖 亲水性和很低的非特异性吸附 具有分子筛效应 交换容量高于纤维素 Pharmacia：Sephadex ：A-25，A-50（阴离子） C-25，C-50（阳离子） 4、离子交换琼脂糖 较葡聚糖凝胶更显多孔结构 牢固，体积受离子强度及pH影响小 Pharmacia：Sepharose HP，FF，BB等系列 一、离子交换剂类型 5、高效离子交换剂 中压或高压色谱 粒度较小，硬度较高，分辨率高 高流速操作 亲水性强，非特异性吸附低，活性回收率高 Pharmacia：SOURCE（Q/S）系列 MonoBeads（Q/S）系列 6、非孔型离子交换剂 高效液相，粒度小，分辨率高，速度快 牺牲交换容量 第三节 离子交换色谱（IEC） 二、流动相：缓冲液和盐 1、缓冲液的类型 A、弱酸（弱碱）及其盐构成 避免缓冲离子所带电荷与离子交换剂上功能基团相反 阴离子交换剂：正电荷缓冲离子 阳离子交换剂：负电荷缓冲离子 磷酸盐缓冲液常用于阴离子交换！ B、兼性离子化合物构成 第三节 离子交换色谱（IEC） 二、流动相：缓冲液和盐 2、缓冲液pH和浓度 起始缓冲液：上样并洗去杂蛋白 浓度 ：10-50 mM。过高或过低？ 洗脱缓冲液：洗脱吸附的蛋白 改变pH 增加离子强度 缓冲能力 有效范围pKa±2 pH 第三节 离子交换色谱（IEC） 二、流动相：缓冲液和盐 3、离子对色谱行为的影响 增加离子强度洗脱，常选用非缓冲盐类（NaCl） 种类和性质影响分辨率和选择性、洗脱顺序发生变化 离子价态高低：多价置换能力高于一价 溶菌酶：NH4 + ＞ Mg 2+ 洗脱盐不参与交换基团与蛋白结合影响色谱行为 先选择通用的，再优化 二、流动相：缓冲液和盐 4、添加剂 增加蛋白溶解度，提高分辨率，保护待分离酶 膜蛋白： 非离子型或兼性离子去污剂 有机溶剂（氯仿、甲醇），降低溶液介电常数，蛋白与交换剂静电作用增强，利于吸附 甜菜碱或牛磺酸：减少蛋白