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低聚半乳糖的组成及其糖苷键异构体的分析 1 2 3 1 1 1* 崔静 陈子健 徐牛生 陈尚卫 朱松 戴军 1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，214122 2.量子高科（中国）生物股份有限公司，529081 3.赛默飞世尔科技中国有限公司生命科学质谱部 低聚半乳糖 (galactooligosaccharide ，GOS)是一种天然存在于动物乳汁和母乳中的具有较 強增殖双歧杆菌活性的功能性低聚糖，工业上一般以乳糖为原料经β—半乳糖苷酶的转糖苷作 用制得。所以低聚半乳糖的分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接 1～7 个半乳糖基， 即Gal–(Gal)n–Glc/Gal (n 为0～6) 。半乳糖之间可以 β( 1→3 、4 、6) 等糖苷键相结合[1] ，其 生物活性与其糖苷键直接相关。因此，分析探明低聚半乳糖产品的不同DP 值糖组分异构体组 成及其糖苷键连结方式对于阐明和论证其产品的质量特性和功能性具有重要意义。本文拟通 过对二糖、三糖的各个异构体色谱峰的MS2 与MS3 的中性丢失离子特征及相对丰度进行分 析及与文献数据比较，初步定性量子高科GOS 产品中二糖及三糖的异构体组成及糖苷键特征。 1. 实验部分 1.1 氨基柱分离制备二糖和三糖 配制浓度为1g/10mL 的GOS （57L ）样液，按如下HPLC 条件分离制备，根据出峰顺序， 将其各组分单独收集起来，浓缩、冷冻保存。仪器：Waters600 HPLC 液相色谱条件 色谱柱：Inertsil 10×250μm ，5μm ； 流动相：乙腈：水=75:25 流速：2.8ml/min 1.2 GOS 及氨基柱分离制备级分的HILIC-MS n 分析 取少量低聚半乳糖样品溶于1ml 水中，取100μl 加到1400μl 乙腈和水的混合溶液中(乙腈： 水，900μl ：500μl)，混匀并过滤后进样10μl 。 液相色谱条件：色谱柱：XBridge amide 4.6×250mm,3.5μm ；流动相：A(H20, 0.1%氢氧化 铵)和B (CH3CN, 0.1%氢氧化铵)二元梯度洗脱，流速：0.4mL/min 。 质谱条件：离子阱质谱，正离子模式， SIM m/z ：365.1, 527.1,689.1,851.2 。 1.3 GOS 不同聚合度比例分析 色谱柱：Waters Sugarpak1,6.8×300mm ；流动相：超纯水；流速：0.4mL/min ；柱温： 85℃ 2.结果与讨论 2.1 GOS 糖苷键异构体的质谱鉴定 图1 为GOS 样品的HILIC-MS n 选择离子色谱图，由该图可见，二糖各异构体分离较好， 可以直接对4个异构体峰的MS2和MS3的中性丢失离子特征及相对丰度进行分析并与文献数 据[2] 比较，推测得到二糖各异构体及其糖苷键如表1所述。此结果与用分离制备二糖组分（图 2 中1～3 ）质谱条件结果相同。 三糖至少有5 个异构体，分离较差，故取GOS 分离制备的4、5两级分分别进行HILIC-MS n 分析，所得SIR 图谱见图3.同样对a，b,c,d,e5 个异构体峰的MS2和MS3的中性丢失离子特征 及相对丰度进行分析并与文献数据[2] 比较，推测得到三糖各异构体及其糖苷键亦列于表1。 四糖及五糖异构体的分离鉴定难度较大，待进一步后续研究。 表1GOS二糖和三糖异构体及其糖苷键推测结果 DP Peak % Identification results number DP2 a 11.35 β-D-Gal-(1→3)-D-Glc b 15.54 β-D-Gal-(1→4)-D-Glc 为主，少量β-D-Gal-(1→2)-D-Glc c 1.1 β-D-Gal-(1→1)-α-D-Glc or β-D-Gal-(1→1)-β-D-Glc d 10.91 β-D-Gal-(1→6)-D-Glc DP3 a