第三章_细胞工程10资料.pptVIP

* 与多数哺乳类动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37℃，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。 细胞培养的pH最适为7.2－7.4之间，当pH低于6或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡 细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的O2及CO2足以保证细胞体内代谢活动的进行，但作为代谢产物的CO2在培养环境中还有另一个重要作用：即调节pH的作用。 10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。 营养要求：除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。 环境要求：包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。受环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。 另外，动物细胞的生长增殖所需时间长，其细胞分裂时间为12～48h。而如大肠杆菌等微生物，甚至半小时就是一个世代。 * 水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。 * 按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。本节提到的是常用的非玻璃化冻存方法。 玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。 * 培养基特有成分的不同，是动物细胞培养与植物细胞培养的最大区别。 * 血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。 如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？ 可以实现吗？有什么技术限制吗？ 很难离体培养B淋巴细胞。 * B细胞首先证明是在鸟类淋巴样器官法氏囊内发育成熟的，故称之为B细胞，发育成熟为浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌；在骨髓内分化成熟；成熟B细胞可定居于周围淋巴组织，如淋巴结的皮质区和脾的红髓及白髓的淋巴小结内。 动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。 * * 注射抗原进行免疫：腹腔注射、皮下淋巴样器官注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射等。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。 注意，两次筛选，目的各异。 * 一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗原）、加强免疫（向动物静脉内注射抗原）三个过程 * 抗原 (50 mg/鼠)混合 0.5 mL弗氏完全佐剂进行初次免疫。 * 末次免疫后的3～5天期间，即可以取出脾脏分离淋巴细胞。收集脾脏细胞时应保持整个过程处于无菌状态。 * * PEG介导的细胞融合： （1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 （2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。 （3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止