(免疫检测技术知识）第6章 放射免疫技术知识-12.ppt

第七章 放射免疫技术 第一节　放射免疫技术 一、原理及分类 二、常用的放射性核素 三、标记物制备及鉴定 第二节　放射免疫分析 一、基本原理 二、实验方法及测定 第三节 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA与RIA的比较 思考题 小结 放射性比度(比放射) 　比放射：单位质量或单位体积的放射性物质的放射性活度称为放射性比度 　　其单位有：kBq/kg、μCi/g 　　放射性比度大于70kBq/kg（0.002μCi/g）的任何物质即为放射性比度 1、放射性强度：称放射性活度，是度量放射性强弱的物理量。 　　采用的单位有： （1） 居里（Curie简写Ci） 　　若放射性同位素每秒有3.7×1010次核衰变，则它的放射性强度为1居里（Ci）。 （2） 贝可勒尔（Becqurel，简称贝可Bq） 　　1贝可表示放射性同位素每秒有一个原子核衰变。 （3） 克镭当量 　　放射γ射线的放射性同位素（即γ辐射源）和1克镭（密封在0.5mm厚铂滤片内）在同样条件下 所起的电离作用相等时，其放射性强度就称为1克镭当量。 第一节 放射免疫技术 早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(radio-immunoassay, RIA，竞争性RIA，又称传统RIA )， 稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(Immunoradiometric Assay, IRMA，非竞争性RIA )。 该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。 125碘-标记物的制备－标记 125I- 化学或酶促反应，将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子，通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子。 125I或125I+ 125I-标记物 （混合物） Ch-T、LPO氧化 取代反应 直接标记法 三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定 使用无还原剂的高比放射性碘源 被标记物用量要少 ch-T用量要低 控制总反应体积200μl 反应时间1-2分钟 弱碱性反应条件 间接标记法 联接标记( bolton-Hunter )预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。 bolton-Hunter 125碘-标记物的制备－纯化 凝胶过滤法 离子交换层 析法 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 高效液相色 谱法 聚合、损伤物 标记蛋白 游离125I 125碘-标记物的制备－鉴定 标记物质量 高比放射性 高纯度 完整免疫活性 放射化学纯度 单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率 应大于95% 免疫活性 标记物与抗体结合的能力 标记物与过量抗体反应百分比 该值越大, 标记物免疫活性好 比放射 单位化学量标记物中所含的放射性强度 单位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性过高，将影响标记物免疫活性 计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性. 自身置换法 ：比较标记抗 原与标准抗原的免疫活性来 测定标记物的比放射性 结果准，测定复杂 比放射性－计算法 结果欠准，计算简便 自身置换曲线 反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原 标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性 标准曲线 反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少 每分钟脉冲数(CPM) 比放射性－自身置换法 标准曲线与自身置换曲线平行 表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合 的抗原物质总量相同 计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算 为nCi/ml) 计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量 (ng/ml) 以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直 线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng) 五、方法学评价 除了常规的灵敏度、精密度、准确性、 特异性和稳定性之外，应注意以下指标： 可靠性 剂量-反应曲线 高剂量钩状效应 双位点(夹心法)一步法具有很高的特异性，可将受检标本和酶标抗体的两步