htert 启动子介导的 e1ail审审24共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究-study on the antitumor effect of htert promoter - mediated e1ail trial 24 co-expression targeting adenovirus vector on hepatocellular carcinoma and its molecular mechanism.docx

hTERT启动子介导的E1A/IL-24共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究中文摘要hTERT启动子介导的E1A/IL-24共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究中文摘要目的构建hTERT启动子介导的E1A/IL-24共表达靶向腺病毒载体（pAd-hTERT-E1A-IL-24），研究其对肝癌的抑瘤效应，并从细胞凋亡和生长周期、血管形成、浸润等方面，探索其抗肿瘤作用的分子机制。方法按分子克隆原理，用套式PCR从MCF-7的DNA基因组中亚克隆出hTERT启动子(hTERTp)，将其插入pTrack质粒转移载体形成pTrack-hTERT。PCR扩增目的片段E1A、polyA-promoter和IL-24基因，依次亚克隆至pTrack-hTERT转移载体，构建pTrack-hTERT-E1A-polyA-promoter-IL-24双基因共表达靶向转移载体。同理构建pTrack-CMV-E1A-polyA-promoter-IL-24双基因共表达转移载体。上述二个构建正确的转移载体及pTrack空载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中同源重组，得到的同源重组质粒pAd-hTERT-E1A-IL-24（靶向）、pAd-CMV-E1A-IL-24及pAd经PacI酶切、再用脂质体转染QBI-293A包装细胞，经多轮感染和扩增后获得高滴度的Ad-hTERT-E1A-IL-24（简称Ad-h-E1A-IL-24）、Ad-E1A-IL-24及Ad病毒子。将5、10、25、50及100MOI的Ad分别感染SMMC-7721肝癌细胞，筛选出Ad的最佳感染剂量为25MOI。将最佳感染剂量的Ad-h-E1A-IL-24和Ad-E1A-IL-24病毒子分别感染SMMC-7721肝癌细胞和HL7702人正常肝细胞，流式细胞仪鉴定两种病毒对该细胞的感染率，MTT鉴定其对正常细胞的毒性作用。将体外培养的SMMC-7721肝癌细胞分成PBS、Ad、Ad-E1A-IL-24及Ad-h-E1A-IL-24组，分别加入最佳感染剂量的上述腺病毒。RT-PCR、间接免疫荧光法和WesternBlot法检测外源性E1A和IL-24在SMMC-7721细胞中的转录与表达；MTT法检测体外抑制肝癌细胞及人正常肝细胞HL7702生长效应，Hoechst33258荧光染色及FCM检测其诱导肝癌细胞凋亡效应，RT-PCR法检测凋亡、细胞周期调节及肿瘤浸润相关的细胞因子Bax、Bcl-2、P21、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2基因的转录表达；并建立裸鼠SMMC-7721人肝癌荷瘤模型，观察体内抑瘤作用。将成瘤后的裸鼠分为PBS、Ad、Ad-E1A-IL-24及Ad-h-E1A-IL-24组，每组5只。病毒干预后测肿瘤体积及瘤重。免疫组化法检测外源性E1A及IL24在荷瘤中的表达，检中文摘要hTERT启动子介导的E1A/IL-24共表达靶向腺病毒载体对肝癌抑瘤效应及其分子机制研究测细胞凋亡、肿瘤浸润及血管形成相关因子Bax、Bcl-2、Fas、Caspase3、MMP2、MMP9、VEGF和CD34的表达。结果成功构建了hTERT启动子和CMV介导的E1A和IL-24共表达腺病毒载体，并得到表达高价Ad-h-E1A-IL-24和Ad-E1A-IL-24的腺病毒载体病毒子。25MOI的最佳感染剂量的Ad-h-E1A-IL24和Ad-E1A-IL24两组病毒子对肝癌细胞的感染率分别65.53%和41.71%（P0.01）。Ad-h-E1A-IL24病毒子对HL7702的毒性作用明显小于Ad-E1A-IL24。RT-PCR检测到外源性E1A和IL-24在SMMC-7721细胞中的转录，间接免疫荧光法和WesternBlot法均检测到外源性E1A和IL-24蛋白在SMMC-7721细胞中的表达。体外研究结果，MTT检测结果表明，Ad-h-E1A-IL-24抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长明显优于Ad-E1A-IL-24组（P0.05）；FCM检测结果显示，与Ad-E1A-IL-24组比较，Ad-h-E1A-IL-24诱导肝癌细胞的凋亡率明显升高（P0.05）；RT-PCR结果显示，Ad-h-E1A-IL-24能明显上调SMMC-7721肝癌细胞中与细胞周期和凋亡相关的因子Bax和P21的表达，下调Bcl-2的表达也更为显著。体内模型抑瘤实验结果显示，Ad-h-E1A-IL-24明显抑制裸鼠SMMC-7721人肝癌荷瘤的生长，明显高于Ad-E1A-IL-24组（P0.05）。同时使肿瘤组织坏死明显增多，肿瘤间质内血管减少。免疫组化结果表明：Ad-h-E1A-IL-24与Ad-E1A-IL-24组比较，前者可明显