结肠癌中β3gnt8与转录因子c-jun的相关性探讨及其在侵袭迁移进程中的功能分析-study on the correlation between β 3g nt 8 and transcription factor c - jun in colon cancer and its function analysis in the process of invasion and migration.docxVIP

中文摘要目的：探究转录因子 c-jun 对糖基转移酶 β3GnT8 的转录调控作用及研究β3GnT8 与 c-jun 在结肠癌侵袭迁移中的分子机制。 方法：（1）培养三种人结肠癌细胞株 SW620、SW480、LoVo，并通过 Western-blot检测这三种结肠癌细胞中 c-jun 和 β3GnT8 蛋白的表达水平及通过 Transwell 法检测 c-jun 和 β3GnT8 高、低表达的细胞在 24h 时的侵袭迁移能力；（2）ChIP 技术检测 c-jun 与 β3GnT8 基因启动子区的结合作用；（3）将 c-jun 过表达质粒、c-jun shRNA 干扰载体及其空载体通过 lip2000 脂质体介导的方法分别转染至 c-jun 和 β3GnT8 蛋白的表达低的 SW480 细胞和表达程度高的 LoVo 细胞中；（4）荧光显微镜观测 转染带有 GFP 标记载体的细胞株，Real time-PCR 及 Western-blot 检测转染后 SW480 中 c-jun 上调后和 LoVo 细胞中 c-jun 下调后 β3GnT8、CD147 以及相关分子的 mRNA 和蛋白的表达变化；（5）流式细胞术检测 c-jun 对 β3GnT8 参与合成的细胞表面多 聚乳糖胺糖链的表达水平；（6）Transwell 和细胞划痕修复实验检测 SW480 中 c-jun 上调后和 LoVo 中 c-jun 下调后，对细胞侵袭和迁移能力的影响；（7）筛选获得 β3GnT8 和 β3GnT2 基因的有效 siRNA 片段；（8）将 c-jun 过表达载体与筛选获得 的 β3GnT8、β3GnT2 基因的最有效干扰片段通过脂质体介导共转染结肠癌 SW480 细胞，RT-PCR 检测 β3GnT8 mRNA 的表达变化，并通过 Transwell 检测各组细胞 的迁移能力。结果：（1）Western-blot 检测三株结肠癌细胞株中 c-jun 和 β3GnT8 的蛋白表达 水平由低到高依次为 SW480→SW620→LoVo，Transwell 结果显示 24h 时 SW480 细胞转移细胞数极少，而 LoVo 转移细胞数很多；（2）ChIP 实验结果显示 c-jun 与 β3GnT8 基因启动子区有相互结合；（3）通过荧光显微镜观察、Real time-PCR 及 Western-blot 检测发现 SW480 中 c-jun 上调后，与空白对照组相比，β3GnT8、 HG-CD147 及 MMPs 的 mRNA 和蛋白表达水平均升高；LoVo 细胞中 c-jun 下调后， 与空白对照组相比，β3GnT8、HG-CD147 及 MMPs 的 mRNA 和蛋白表达水平均下 降；（4）流式细胞术实验结果显示，SW480 中 c-jun 上调后，与空白对照组相比， 细胞表面多聚乳糖胺链含量增加；LoVo 细胞中 c-jun 下调后，与空白对照组相比， 细胞表面多聚乳糖胺链含量降低；（5）细胞划痕损伤修复实验显示 SW480 中 c-jun中文摘要结肠癌中 β3GnT8 与转录因子 c-jun 的相关性探讨及其在侵袭迁移进程中的功能研究上调后，与空白对照组相比，损伤程度变小，提示细胞迁移能力增强；而 LoVo 细胞中 c-jun 下调后，与空白对照组相比，损伤程度变大，提示细胞迁移能力降低；（6）Transwell 小室检测发现 SW480 中 c-jun 上调后，与空白对照组相比，穿膜细 胞数明显增多，提示细胞侵袭和迁移能力增强；而 LoVo 细胞中 c-jun 下调后，与 空白对照组相比，穿膜细胞数明显降低，提示细胞侵袭和迁移能力降低。（7）Real time-PCR 筛选获得 siβ3GnT8-1754 和 siβ3GnT2-1336 两个最有效干扰片段，与 c-jun 过 表 达 载 体 共 转 染 SW480 细胞后， RT-PCR 检 测 结 果 显 示 ， 与 单 独 转 染 siβ3GnT8-1754 和 siβ3GnT2-1336 组相比，共转染组 β3GnT8 mRNA 的表达升高， 且高于未处理组；并用 Transwell 检测发现共转染组穿膜细胞数较 c-jun 过表达组 明显减少，较单独转染 siβ3GnT8-1754 和 siβ3GnT2-1336 组升高。结论：（1）三株结肠癌细胞株中 c-jun 和 β3GnT8 的蛋白表达水平由低到高依 次为 SW480→SW620→LoVo 2）转录因子 c-jun 可能通过调节糖基转移酶 β3GnT8 的表达来影响靶糖蛋白 CD147 的糖基化修饰水平进而参与细胞的转移进程。关键词：β3GnT8，c-jun，HG-CD147，多聚乳糖胺链，侵袭迁移作者：于美云 指