分子生物学-15-3-新一代测序技术知识.pptVIP

每一条双链退火成为单链 双链经再次变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应 ，反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇群” SOLEXA 这样的芯片上一次反应可以产生成千上万个DNA单分子 SOLEXA ”DNA簇群“在Genome Analyzer 综合分析仪上进行序列分析 专利的“可逆性末端终结反应”进行测序 设计了特殊的四种荧光标记的可逆性的末端终止子terminator，加入引物，DNA聚合酶等，开始第一轮化学反应，比如加入荧光标记的T，这样只有那些第一个碱基是A的才能够配对，才能发光 SOLEXA 可逆阻断反应Reversible Terminator Chemistry O PPP HN N O O cleavage site fluor 3’ block Next cycle Incorporation Detection Deblock; fluor removal O DNA HN N O O 3’ O 5’ free 3’ end X OH 阻断修饰基团 由于芯片上有成千上万的单链，加入四种不同的荧光标记的dNTP后，总有可以配对的扩增，可以通过检测芯片上 的荧光信号知道是那条单链上正确扩增了，从而知道它的序列，这是第一碱基的序列，然后移除多余的碱基，准备下一个碱基的扩增（测序） SOLEXA 进行第二轮反应， SOLEXA 检测芯片上 的荧光信号，这样就测序了第二碱基的序列 SOLEXA 如此多个循环之后，就能够知道全部的序列 SOLEXA solexa技术特色突出表现在： 每张芯片有8个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测 一次实验可读取10亿个碱基/芯片 可精确读取重复序列如AAAAAAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTTTT 实验费用低，读取1百万碱基的成本最低至4美元 无需建库，自动化样品制备，简单，成本低 样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测 （1 ug DNA即可以进行末端双向测序反应） 可以进行35碱基长度的末端双向测序反应 Clonal Single Molecule Arrays ~1000 molecules per ~ 1 μm cluster ~1000 clusters per 100 μm square ~40 million clusters per experiment Prepare DNA fragments Ligate adapters Attach single molecules to surface Amplify to form clusters 20 microns Sequence Sequencing-by-Synthesis (SBS) 5’ G T C A G T C A G T C A G T 3’ 5’ C A G T C A T C A C C T A G C G T A First base incorporated Cycle 1: Add sequencing reagents Remove unincorporated bases Detect signal Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat All four labelled nucleotides in one reaction High accuracy Base-by-base sequencing No problems with homopolymer repeats Solexa技术在应用中的特点 ? 1.不受物种限制，对人，动物，微生物，植物都可进行研究 ? 2.高灵敏度，精确性，及重复性 ? 3.无需预先知道模式物种基因组序列，无须合成探针，可直接进行全基因组表达研究 ? 4.不需要实验假设的支持 ? 5.可以检测到单拷贝分子的变化 ? 6.没有传统方法的荧光背景噪音的干扰 Integrated Platform for Genomic Analysis Genomic DNA mRNA Small RNA ChIP-Sequencing Digital Karyotyping DNA Methylation 总结solexa测序： 专利的“可逆性末端终结反应”，提高碱基合成来进行测序。 四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列。 芯片上的桥式PCR Calling SNPs with high confidenc