扬州大学《现代分子生物学》5-分子生物学研究基本方法.pptVIP

第五章 分子生物学研究方法;5.1 重组DNA技术发展史;5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 ;重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) ;5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 ;5.1.5重组DNA技术的意义 ;酶类;限制性核酸内切酶;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。;Bam HⅠ;DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。 T4ˉDNA连接酶 EcoR I 连接酶 T7ˉDNA连接酶;目的基因的来源;（八）重组实验中的主要载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 ;个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;5.2.1 细菌转化;常用的转化方法：; 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。;5.2 常见的DNA操作技术;P153;电击转化：;克隆的筛选：;?-互补筛选;蓝白斑筛选;蓝白斑;转化率的计算：;5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术;反应体系;　 PCR的基本反应步骤： 1. 变性：95℃ ，模板DNA变性为单链； 2. 退火：50℃左右，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：72℃ ，DNA聚合酶以dNTP为底物催化 DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25-30次循 环后，可将模板DNA扩增达百万倍。;PCR技术在基因克隆方面的应用 ;5.2.3 cDNA文库;构建步骤：;5.2 常见的DNA操作技术;5.2 常见的DNA操作技术;文库中筛选目的基因;5.2.3 SNP技术应用;5.2.4 基因敲除技术（gene knock-out）;完全基因敲除 条件型基因敲除 植物基因敲除株系筛选（T-DNA插入失活）;5.3 基因克隆技术简介;mRNA的获取;5.3.1 cDNA差示分析法(cDNA-RDA法);5.3 基因克隆技术简介;5.3.3 酵母双杂交体系?（Yeast tow-hybrid system）?;5.3 基因克隆技术简介;主要实验过程： a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株 b. 研究的猎物(或称靶蛋白)蛋白的基因与编码AD的序列结合 c.诱饵(bait)蛋白的基因与编码BD的序列结合,形成两段融合基因 d. 将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录）的阳性菌落。 ;酵母双杂交系统的应用：; ?1986年提出，根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但必须建立遗传分离群体 主要用于与遗传病相关基因等致病基因的克隆;1、将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记 2、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来 3、鉴定目的基因;染色体步移： 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆”，利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反复即可取到需要要得克隆，获得目的基因。 ;;5.4 基因表达研究技术;蛋白质组学：蛋白质和基因组研究相结合，研究某一物种、个体、器官、组织、或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。;（一）、双向电泳技术 （二）、质谱技术