利用酵母双杂交系统筛选pedv蛋白间互作及与nsp14 nsp16互作的宿主蛋白-screening pedv protein interactions and host proteins interacting with nsp 14 nsp 16 by yeast two-hybrid system.docx

华中农业大学2016届硕士学位论文3．2．9酵母感受态细胞的制备及转化243．2．10酵母表达质粒的自激活活性和毒性检测．253．2．11酵母回复杂交验证实验．253．2．12酵母双杂交cDNA文库的构建253．2．13利用酵母双杂交系统筛选eDNA文库273．2．14酵母质粒抽提．283．2．15质粒的转染(脂质体介导的瞬时转染法)．283．2．16WesternBlot检测目的基因在真核细胞中的互作283．2．17间接免疫荧光共聚焦检测蛋白质的亚细胞定位．30第4章结果与分析．314．1PEDV各基因酵母表达质粒自激活活性和毒性检测．314．2利用酵母双杂交系统检测PEDV蛋白问的相互作用314．3猪小肠上皮细胞酵母双杂交eDNA文库的构建及鉴定334．3．1猪小肠上皮细胞总RNA的提取及鉴定334．3．2LD．PCR扩增ds—cDNA并纯化344．3．3猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的建立及鉴定一354．4nspl4、nspl6筛选猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库354．5酵母回复杂交实验验证nspl4、nspl6与宿主蛋白的相互作用374．6免疫共沉淀实验验证nspl4、nspl6与宿主蛋白的相互作用404．7间接免疫荧光实验验证nspl6与DDIT4、UBE2K的共定位一4l第5章讨论与结论．435．1利用酵母双杂交技术筛选PEDV蛋白问的相互作用435．2构建猪小肠上皮细胞酵母双杂交eDNA文库445．3nspl4、nspl6筛选猪小肠上皮细胞eDNA文库445．4结j忿一45参考文献46致谢．．57Il万方数据利用酵母双杂交系统筛选PEDV蛋白间互作及与nspl4、nspl6互作的宿主蛋白摘要猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，主要特征表现为急性肠炎、呕吐、腹泻和脱水，各年龄阶段的猪均易感，初生仔猪最为严重，发病率和死亡率极高，给养猪业造成了巨大的经济损失。酵母双杂交系统是目前研究蛋白质问相互作用的一种有效技术，该系统灵敏性高，能检测到生物体内很弱的蛋白质相互作用。本研究主要利用酵母双杂交系统探究PEDV各病毒蛋白间存在的相互作用以及分别筛选与PEDVnspl4、nspl6存在相互作用的宿主蛋白。主要研究内容如下：1．酵母双杂交实验分析PEDV各蛋白问的相互作用首先，构建PEDV除nspll外所有病毒蛋白的两套酵母融合表达质粒，包括诱饵蛋白质粒pGBKT7一X(bait)和猎物蛋白质粒pGADT7一X(prey)共44个，对其进行自激活活性和毒性检测，发现pGBKT7一nspl5、pGADT7一nsp4、pGADT7一nsp5、pGADT7一nspl5对酵母Y2H菌株有一定毒性，pGBKT7一nsp3一l有自激活活性(不能用于酵母双杂交实验)。然后，将所有bait和prey质粒以点对点的方式两两共转化酵母Y2H菌株以检测PEDV各蛋白间存在的相互作用，通过酵母双杂交实验共筛选了462组互作，结果筛选到46组存在相互作用，包括29组单向互作，12组双向互作及5组自身互作。2．猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定首先在体外培养猪小肠上皮细胞并提取其总RNA，以总RNA为模板合成含有与pGADT7．Rec线性载体同源末端的ds—eDNA，然后将ds—eDNA与pGADT7一Rec共转入酵母Y187菌株中，通过同源重组获得酵母双杂交eDNA文库，最后将所有克隆收集并分装成lml文库用于双杂交筛选。本实验成功构建并鉴定了一个较高质量的猪小肠上皮细胞酵母双杂交eDNA文库，文库滴度6．5×108cfu／mL，文库容量1．04×1011cfu。3．筛选cDNA文库以获得与PEDVnspl4、nspl6相互作用的宿主蛋白将诱饵蛋白质粒pGBKT7一nspl4和pGBKT7一nspl6分别转化Y2H菌株，转化产物分别与lmL猪小肠上皮细胞酵母双杂交eDNA文库共培养，通过对文库的筛选分析得到nspl4和nspl6的潜在互作宿主蛋白。通过酵母回复杂交实验发现nspl4与宿主蛋白CCT7、EIF3I存在相互作用，nspl6与宿主蛋白DDIT4、UBE2K、UBA52存在相互作用。通过免疫共沉淀实验进一步发现，在HEK293T细胞中nspl6与宿万方数据华中农业大学2016届硕_上学位论文主蛋白DDIT4、UBE2K存在相互作用，nspl4与所检测宿主蛋白没有相互作用。通过共定位实验发现nspl6与DDIT4、nspl6与UBE2K均共定位于细胞质。4．关键词：猪流行性腹泻病毒；酵母双杂交；eDNA文库；相互作用万方数据利用酵母双杂交系统筛选PEDV蛋白问