辣椒溶杆菌x2-3筛选鉴定及其β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达-screening, identification and cloning and expression of β - 1,3 - glucanase gene of capsicum frutescens x2 - 3.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文摘要植物土传病害常由多种病原物引起，由于病原种类多、影响发病因素复杂，因此一 直是农业生产上最难治理的病害之一。利用植物根际有益微生物控制土传病害具有独特 的优势。植物根围存在多样性的微生物群体，它们在植物病害防治、促进植物生长等方 面发挥了重要作用。常见的植物根际细菌包括Paenibacillus spp．，Bacillus spp．，Pseudomanas spp．及 Burkholderia spp．等多种类型，统称为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacterium，PGPR)。筛选获得有益的微生物种群是此类研究的重要环节。本研究从 筛选获得的多个PGPR菌株中选择抑菌作用相对较好的菌株X2—3，对其抑菌作用、促进种子萌发等进行了分析。在此基础上，对其编码的p一1，3一葡聚糖酶基因进行克隆、表 达和活性分析，为进一步了解其生物防治机理提供依据。具体研究结果如下：1．菌株X2．3的筛选、鉴定及生物学特征 从山东寿光等地采集根际土壤，采用平板稀释法获得具有抗菌作用的细菌分离物。经与Rhizoctonia cerealis及Bipolaris soroMnmna对峙培养，获得拮抗活性较好的菌株 X2—3。经形态观察、16S rDNA序列分析，将菌株X2．3鉴定为辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)。经不同培养基培养，发现该菌株在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞 壁、昆布多糖和脱脂奶粉等培养基可形成明显的透明圈，表明该菌具有B．1，3．葡聚糖酶 和蛋白酶产生能力。2．L apsici)(2-3对其它病原菌的抑菌活性分析 采用平板对峙法对该菌株的抑菌作用进行分析，结果表明菌株X2．3对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia．cerealis)、烟草根黑腐病菌 (Thielaviopsis basicola)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana))等多种植物病原真菌 和烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitica Var．nicotianae)及终极腐霉(Pythium ultimum) 等卵菌有不同程度的抑菌作用。3．L capsici X2-3对小麦种子萌发的影响 采用浸种法对小麦品种鲁麦21和青麦H03进行处理，发现X2．3可明显促进种子萌发，处理后4d，2个品种的小麦主根长度分别比对照增长36．9％和9．7％，侧根长度比对照增长53．8％和14．8％。盆栽实验表明，X2．3处理可减轻小麦根腐病的发生，病情万方数据辣椒溶杆菌x2．3的筛选鉴定及其争l，3-葡聚糖酶基因的克隆与表达指数对对照减少7．3％。4．L capsici X2-3 B一1,3一葡聚糖酶基因克隆与表达 根据已报道的产酶溶杆菌(厶enzymogenes)菌株C3、OHII、N4—7的p一1，3一葡聚糖酶基因的同源序列合成引物，经PCR扩增，从L capsici X2—3的全基因组DNA中克 隆到3个编码p一1，3一葡聚糖酶编码的基因，即gluA、gluB和gtuc，经序列测定，发现3 个基因大小分别为765bp、1200bp和1 149bp。用DNAMAN将所测3个基因的核苷酸序列翻译成氨基酸，并与产酶溶杆菌中相应氨基酸序列进行比对，发现gluA、gluB和e,t”c与产酶溶杆菌中相应序列相似性分别达 到96．36％、94．99％、95．89％。其中，L．capsici X2—3的gluA的氨基酸数目与产酶溶杆 菌C3、OHll、N4—7的gluA氨基酸数目完全一致。厶capsiciX2—3的gluB比产酶溶杆 菌C3、OHll、N4．7的gluB多出了4个氨基酸，位置是在GLUB蛋白的第17个氨基酸到第20个氨基酸，序列为GVAG。L．capsici X2．3的咖C序列比产酶溶杆菌C3、OHll、N4—7的gluC的氨基酸序列少了1个氨基酸(甘氨酸)，位置是在GLUC蛋白第258个 氨基酸处。将经过BamHI和Nod双酶切的gluA、gluB和gtuC基因和原核表达载体pEHISTEV 连接，转化E．coli(Rossetta)，构建原核表达菌株pE—GIuA、pE—GIuB和pE—GluC。经IPTG 诱导后，目的蛋白得到大量表达；经SDS．PAGE电泳检测，pE．GluA和pE—GluB分别在 29KDa和44．3KDa处有一条明显的条带。蛋白大小与预测的蛋白分子量大小一致。而空 载体pEHISTEV转化E．coli(Rossetta)贝．IJ无相应蛋白产生。利用镍离子柱纯化GLUA和GLUB蛋白，DNS比色法测定两种酶的活性，发现 GLUA和GLUB酶