流感病毒与呼吸道合胞病毒双重感染balbc小鼠的研究-study on the double infection of influenza virus and respiratory syncytial virus in bal bc mice.docxVIP

研究生优秀毕业论文北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文1．2．9小鼠肺组织切片及HE染色．．291．2．10小鼠肺组织悬液制备311．2．11噬斑法检测肺悬液的病毒311．2．12小鼠肺总RNA提取．．321．2．13病毒RNA提取．．331．2．14普通RT．PCR检测肺部病毒．331．2．15病毒检测引物及探针331)定量引物及探针设计332)引物和探针的特异性和灵敏性341．2．16病毒拷贝数定量参考标准品RNA制备一341)基因片段选择和引物设计．．342J T7启动子序列构建353)参考标准品RNA体外转录及纯化361．2．17小鼠肺组织病毒载量检测371．2．18病毒拷贝数计算371．2．19小鼠呼吸道病理切片制备381．2．20病理切片HE染色．381．2．21石蜡切片免疫组化(IHC)检测抗原．381．3结果及分析401．3．1小鼠表现及体重检测．401．3．2病原学分析．411．3．2．1双重感染的建立．411．3．2．2病毒载量检测．421．3．3小鼠肺石蜡切片HE染色分析，免疫组化检测病毒．441．3．4病理研究小结：．531．3．5淋巴细胞及Th细胞亚群的免疫机制．．561．3．5．1 CD3+，CD4+,cD8+细胞比例．571．3．s．2 Thl和Th2细胞581．3．5．3 Thl7细胞比例分析．．591．3．5．4 Treg细胞比例分析601．3．6 BALF中细胞因子浓度．541．4讨论．．611．4．1病毒性呼吸道感染的常见临床症状．611．4．2双重感染中的抗病毒免疫机制．641．4．3 Th亚群相关性分析．691．s小结．71参考文献72附录I主要溶液配制84万方数据北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文摘要呼吸道感染是临床常见疾病，在众多病原体中能导致呼吸道急性炎症并具有较 高致病率和致死率的两个病毒是流感病毒(Influenza Virus，or Flu)和呼吸道合胞病 毒(Respiratory Syncytial Virus，or RSV)。WHO对呼吸道感染致病的传播监测及病原 体检测的机构在不同国家和地区新增了不少合作机构，足见全球卫生组织对呼吸道 疾病的重视程度，在这个最具权威的国际组织影响和呼吁下，全球的科研卫生机构 都对接触到的病例和临床样本进行了详细的检查和统计分析。有研究表明，在呼吸 道致病病原体中，其中所占比例最高的是病毒引起，在病毒性呼吸道疾病中，又以 流感和呼吸道合胞病毒为主，如在临床1个月至5岁的婴幼儿，6岁至24岁的青少 年，以及25岁至65岁人群感冒样病例中，由病毒引起的病例约占45％，在共感染 2种以上呼吸道病毒的人群中，RSV检测阳性的人群比例约为50％，其次是A型和B 型流感病毒，分别为9．84％和10．39％，由于呼吸道病毒的传播范围广，引起的急性 呼吸道炎症比较严重，流感病毒和呼吸道合胞病毒的感染人群几乎覆盖了所有年龄 阶段，况且这两种病毒都没有可以大规模使用的有效疫苗，且在感染后对人类社会 造成的危害和损失是不可估量的，在这样的情况下，开展对这两个病毒的研究是必 须和必然的。为了研究双重感染流感病毒和呼吸道合胞病毒在不同感染次序条件下，宿主免 疫系统抗病毒免疫的相关机制，我们建立了双重感染流感病毒(HINl，A／Puerto Rico／8／34)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV，Long)的BALB／c小 鼠模型来研究这两种病毒在成功感染后对小鼠免疫系统的影响。利用流式细胞分析 法，免疫组化和病理学方法，蛋白质悬浮芯片法，结合对小鼠的日常观察和解剖过 程中的观察来研究小鼠的免疫反应，通过考察小鼠Thl，Th2，Thl7和Treg细胞亚群的比例以及CD4，CD8细胞比例的变化情况，结合病毒载量和炎症程度的结果来解释说明双重感染后，小鼠免疫系统中CD4+T细胞的极化方向，以及在改变病毒感 染次序后又有何种变化。结果显示，1)病理学研究结果表明：双重感染流感病毒和呼吸道合胞病毒的小 鼠，其呼吸道组织损伤较单独感染其中一种病毒的较严重，又以首次感染呼吸道合 胞病毒再感染流感病毒的小鼠最严重；2)流式细胞分析结果表明：在双重感染的 不同阶段，小鼠CD4+T细胞的比例在各亚群中分布不同，在双重感染初期，首次感 染流感病毒再感染呼吸道合胞病毒的小鼠以Th2类细胞免疫反应为主，而当改变感 染次序后，则Thl和Th2类免疫反应水平相同，在感染中期，首次感染流感再感染 呼吸道合胞病毒的小鼠其Thl和Th2类免疫反应达到相同水平，而首次感染呼吸道 合胞病毒再感染流感的小鼠开始向Th2类免疫反应转换；在双重感染的后期，两种 感染次序的小鼠都倾向于Thl类免疫反应。双重感染流感病毒和呼吸道合胞病毒能