免疫药理实验方法学-高建平2.pptVIP

第六讲 免疫药理实验方法 公认的对免疫功能有影响的中药包括： 补虚药（增强免疫）； 清热、解表药（双重调节）； 祛风湿药（抗过敏；双重调节免疫）； 利水渗湿类方药、安神类方药（增强免疫） ； 芳香化湿（抗过敏）； 泻下、活血化瘀药、止血药等（增强免疫） 非特异性免疫功能 一、影响非特异性免疫功能的方法 （一）免疫器官重量法 【机理】机体的主要免疫器官是胸腺和脾脏，一般 常以动物的胸腺和脾脏重量的影响作为初步观察药物 对免疫功能影响的指标。 【操作举例】选择体重14-20g之间的年幼小鼠，雌 雄皆可，每日给受试药，连续给药7-10d。禁食不禁 水12~16h，称体重，放血处死动物，剥离脾脏和胸 腺，称重，计算脏器重量和体重之比作为胸腺及脾脏 指数。 【方法说明】可以药物对正常、免疫功能低下或者 荷瘤等不同病理状态下小鼠免疫器官指数影响的实验 。免疫功能低下小鼠造模方法可以采用糖皮质激素、 环孢素或者环磷酰胺等造模。 【评价】此法操作简单，可供研究药物初筛时用， 结果与其他免疫指标结果平行，结果可靠。为节约动 物，可以与其他实验在同一动物身上配合进行。 【注意】通常用年幼动物，因幼鼠胸腺对免疫药物 敏感。 （二）单核吞噬细胞功能测定法 1、小鼠碳粒廓清法 2、腹腔巨噬细胞功能测定法 1、小鼠碳粒廓清法 【原理】常用一些颗粒状异物（如墨汁、胶体碳、 刚果红染料等）静脉注入小鼠体内后，异物迅速被 肝和脾脏的单核吞噬细胞（Kuffer细胞约吞噬90%， 脾脏巨噬细胞吞噬10%）所清除。若将异物量恒定， 则从血流中清除的速率可以反应单核吞噬细胞的吞 噬功能。 【操作过程】 取成年小鼠，随机分组，经过一定时间药物处理后， 于末次给药30min后，尾静脉注射异物（印度墨汁） 0.05-0.1 ml/10g，注射后2min、20min （或每隔5min）不同时间从眼眶后静脉丛取血20ul， 溶于2ml 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，分光光度计600- 680nm下比色，测定OD值。处死小鼠，分别称取肝和 脾脏重量，按公式计算廓清指数K或矫正廓清指数A。 logOD1-logD2 K= t2 – t1 A=3√K×体重 /（肝重+脾重） 【备注】廓清指数大，说明单核-吞噬细胞系统清 除异物颗粒-碳末颗粒的作用强。 【注意事项】 ①印度墨汁应先用生理盐水稀释5-10倍左右； ②保证尾静脉注射印度墨汁的剂量及眼眶静脉丛 取血时间的绝对准确；③如果肝重和脾重差异不 大的话，只计算K值亦可。 【方法说明】 受试动物可以采用正常、免疫功能低下或者荷 瘤等不同病理状态下小鼠进行。 2、腹腔巨噬细胞功能测定法 【机理】于鼠类腹腔注射鸡红细胞后，可被腹腔巨 噬细胞吞噬，隔一段时间后，吸取腹腔巨噬细胞， 镜检其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指数的高 低表示巨噬细胞吞噬功能的大小。 【操作举例】 小鼠（正常或模型），随机分组，给药7-10d。末 次给药后，腹腔注射1%-5%鸡红细胞0.5ml，于给鸡 红细胞后1-12h，处死小鼠，剪开腹腔皮肤，腹腔注 射Hank’s溶液或生理盐水2-3ml，轻揉小鼠腹部后， 吸取腹腔冲洗液离心后涂片，37℃温育30min后以生 理盐水冲去多余未贴壁的巨噬细胞，晾干后Giemsa 染色。油镜下观察，计数巨噬细胞中吞噬鸡红细胞 的巨噬细胞百分率及吞噬指数。 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 吞噬百分率= ×100% 100个巨噬细胞数 被吞噬的鸡红细胞数 吞噬指数= 100个巨噬细胞 【注意事项及评价】 ①最好避免腹腔注射给予受试药物 ②受试药物如果是免疫抑制剂，可先腹腔注射巨噬细胞的诱导剂（如0.5%水解蛋白） ③特异性不强，操作欠精确。 ④应配合其他方法综合评价。 （三）巨噬细胞吞噬功能实验（体外法） 1、巨噬细胞吞噬作用的化学发光测定法 （呼吸爆发） 【原理】巨噬细胞吞噬颗粒或受其他生物学与化学因 子刺激后，细胞代谢猛增，其特征是氧耗量增加，产生 超氧负离子、过氧化氢、羟自由基以及单线态氧等自由 基，同时伴有弱的化学发光现象，在细胞体系中加入鲁 米诺等发光增强剂，能增强发光。 【评价】 本法检测吞噬颗粒时伴有的代谢改变，而其他生 物学或化学刺激亦可诱导代谢改变，故作为检测吞 噬功能的指标专一性不够。 2、巨噬细胞吞噬燃料法（中性红