苦参生物碱对k562细胞丙酮酸激酶的作用分析-effect of sophora flavescens alkaloids on pyruvate kinase in k562 cells.docxVIP

中 文 摘 要背景简述中药苦参味苦性寒，始载于《神农本草经》，主要含苦参碱和氧化苦参碱 等生物碱，常被中医临床组方于清热解毒方中用于肿瘤治疗。当前关于苦参碱抗白血病机 制的研究主要集中在抑制增殖、诱导分化和凋亡，及逆转耐药等方面，而对细胞活动最基 本要素—物质和能量代谢方面作用的研究则很少见于报道。细胞通过物质代谢获取能量支 撑生命活动，肿瘤细胞增殖旺盛，需增强糖代谢以获取更多的能量，因此靶向抑制肿瘤细 胞旺盛的物质和能量代谢是目前研究肿瘤治疗的选项之一。本研究以白血病K562细胞为研 究模型，从抗癌药物靶向作用肿瘤细胞物质和能量代谢的角度，探讨苦参中主要生物碱抗 白血病的作用机制。研究目的本研究旨在从糖代谢的角度选取糖酵解关键酶丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)作为抑制肿瘤增殖的靶点，探讨苦参及所含主要生物碱苦参碱、氧化苦参碱， 或苦参碱联合氧化苦参碱抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡等可能机制。研究内容 首先通过建立高效液相色谱方法，测定苦参碱作用白血病细胞后在细胞培 养体系中的含量分布，以便为后续研究提供苦参碱作用浓度和时间的依据。将苦参液、苦 参总碱、苦参碱、氧化苦参碱，或苦参碱联合氧化苦参碱作用白血病K562细胞，通过丙酮 酸激酶活性测定实验，了解各药物组是否可抑制丙酮酸激酶的活性，以探明各实验组是否 通过抑制K562细胞丙酮酸激酶的活性从而阻断糖酵解途径，达到抑制增殖的作用。最后通 过测定糖酵解代谢终产物乳酸生成情况进一步验证实验结果。实验方法 1. 使用 HPLC 建立苦参碱浓度与检测峰面积对应的标准曲线，然后取对数 期生长的 K562 细胞，加入苦参碱并调整其浓度分别为 400μg/mL、200μg/mL 作用培养 细胞，按不同时间点分别收集培养液和细胞，并裂解细胞，用 HPLC 法测定培养基和细胞 裂解液（即细胞内）的苦参碱含量。2. 利用丙酮酸激酶活性测定试剂盒测定苦参碱、氧化苦参碱、苦参碱联合氧化苦参碱 各实验组先作用 K562 细胞一定时间后，再裂解细胞，并测定细胞裂解液中丙酮酸激酶的 活性。取对数生长期 K562 细胞分别加入苦参碱、氧化苦参碱，并调整其浓度分别为 400 μg/mL 和 200μg/mL，苦参碱联合氧化苦参碱实验组为苦参碱和氧化苦参碱各自按 400μ g/mL 和 200μg/mL 等比例加入细胞培养体系，培养 3 天。然后换入新鲜培养基，调整培 养体系中的药物浓度与上述一致，继续培养 3 天（简称 3+3 组），或继续培养 4 天（简称3+4 组），取出细胞裂解。按试剂盒操作方法，用紫外分光光度计测定并计算各实验组对丙酮酸激酶的活性的影响。每组均设置阴性对照，且每组都重复培养、测定三次。3. 利用丙酮酸激酶活性测定试剂盒直接测定细胞裂解液中丙酮酸激酶的活性。取对数 生长期的 K562 细胞，先裂解细胞，在酶活性测定体系中先分别加入适当浓度的苦参提取 液（简称苦参液）、苦参总碱、苦参碱、氧化苦参碱，及苦参碱等比例浓度联合氧化苦参 碱等药物，再在各实验组加入含丙酮酸激酶的 K562 细胞裂解液，按前述同样的方法测定 裂解液中丙酮酸激酶的活性。每组均设置阴性对照组，且每组测定三次。4. 利用 HPLC 建立测定培养液中乳酸浓度。取对数生长期的 K562 细胞，加入苦参碱 和氧化苦参碱，使其终浓度分别为 400μg/mL、200μg/mL，然后培养 3 天。取培养基测 定其中的乳酸浓度，培养瓶换入新鲜的培养基并重新调整相应的药物浓度与更换前相同， 相同条件再次培养 24、48h、72 小时，取出培养基并利用 HPLC 测定其中乳酸浓度。每组 均设置阴性对照，且每组都重复培养测定三次。实验结果 1. 培养体系中苦参碱浓度分布：苦参碱作用于 K562 细胞后，培养基中的 苦参碱含量下降，200μg/mL 苦参碱处理组下降至 190μg/mL 左右，400μg/mL 苦参碱处 理组下降至 390μg/mL 附近，大约 24 小时后趋于稳定。与对照组比较，200μg/mL 或 400 μg/mL 苦参碱处理的 K562 细胞裂解液（细胞内）的苦参碱有所升高。2. 实验组药物先作用 K562 细胞，再裂解细胞测定其丙酮酸激酶活性：分别为 200μ g/mL、400μg/mL 苦参碱、氧化苦参碱，及分别为 200μg/mL、400μg/mL 的苦参碱联合氧 化苦参碱作用 K562 细胞，其丙酮酸激酶的活性抑制率分别为：(1)苦参碱(3+3 组) 0.56±0.97%（200μg/mL）、2.66±2.31%（400μg/mL）；(3+4 组)2.73±2.74%（200μg/mL）、 4.06±2.00%（400μg/mL）；(2)氧化苦参碱(3+3 组) 1.35±0.66%（200