利用串联亲和纯化研究ehec o157h7 ⅲ型分泌系统分子伴侣蛋白复合物-study on the molecular chaperone protein complex of ehec o157h7 ⅲ secretion system by tandem affinity purification.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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利用串联亲和纯化研究ehec o157h7 ⅲ型分泌系统分子伴侣蛋白复合物-study on the molecular chaperone protein complex of ehec o157h7 ⅲ secretion system by tandem affinity purification.docx

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利用串联亲和纯化研究ehec o157h7 ⅲ型分泌系统分子伴侣蛋白复合物-study on the molecular chaperone protein complex of ehec o157h7 ⅲ secretion system by tandem affinity purification

have been developed, which could purify protein complexes containg tagged target protein from E.coli with high specificity and analyze protein interaction between components of complex. These techonologies could be used in not only E.coli, but also other pathogens like shigella. This study provided fundamental theoretical and experimental bases for further studies, such as constructing protein intercation network of TTSS relevant virulence proteins and overall studies of mechanisms of TTSS.Key Words: Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7; Chaperones; Tandem Affinity Purification; Protein ComplexesDirected by: Prof. Huhebateer and Yue JunjieApplicant for Doctor degree: Wei Bo( Parasitic diseases and prevention ) (College of Veterinary Medicine. Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018. China)目录1引言11.1肠出血型大肠杆菌 O157:H711.1.1EHEC 与 EPEC 致病性的比较11.1.2肠出血型大肠杆菌21.1.3III 型分泌系统61.2蛋白质复合物的研究131.2.1研究蛋白质复合物的意义131.2.2蛋白质相互作用的经典研究方法131.2.3串联亲和纯化161.2.4蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue Native PAGE，BN PAGE)...181.2.5质谱技术181.3本课题的研究目的与意义202串联亲和纯化原核表达载体的构建及表达鉴定212.1实验材料212.1.1菌株和质粒212.1.2试剂与耗材212.1.3主要仪器212.1.4主要溶液的配制222.2实验方法252.2.1pCTAP 与 pNTAP 串联亲和纯化表达载体的设计策略 252.2.2pCTAP 与 pNTAP 串联亲和纯化原核表达载体的构建 26pNTAP 与 pCTAP 表达载体标签蛋白在 E.coli BL21(DE3)中的表达..30pNTAP 与 pCTAP 在 E.coli O157:H7 EDL933 感受态细胞中的表达 ..322.3实验结果332.3.1pCTAP 与 pNTAP 合成序列的密码子优化 332.3.2拼接模板全长的 PCA 结果与 PCR 扩增结果 332.3.3载体 pUC18 质粒双酶切及阳性转化子 PCR 鉴定 342.3.4基因序列测定结果352.3.5pCTAP 与 pNTAP 载体在大肠杆菌 BL21(DE3)细菌中的表达鉴定 352.3.6pCTAP 与 pNTAP 载体在大肠杆菌 O157:H7 菌株中的表达鉴定 372.4讨论382.4.1串联亲和纯化表达载体的设计 382.4.2串联亲和纯化表达载体 pNTAP 与 pCTAP 的构建 392.4.3串联亲和纯化表达载体 pNTAP 与 pCTAP 的表达鉴定 393利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌 O157:H7 伴侣蛋白 GroEL 复合物 413.1实验材料413.1.1菌株和质粒413.1.2试剂与耗材413.1.3主要仪器413.1.4主要溶液的配制413.2实验方法44构建重组表达载体 pGroEL-TAP 44GroEL-TAP 串联亲和纯化 463.2.3SDS分离蛋白复合物组分 483.2.4BN分离蛋白复合物组分 493.2.5胶内酶切和质谱鉴定493.3实验结果503.3.1构建 pGroEL-TAP 表达载体 503.3.2pGroEL-TAP 载体在大肠杆菌 O157:H7 菌中的表达鉴定 513.3.3串联亲和纯化条件的优化523.3.4伴侣素 GroEL 蛋白的串联亲和纯化 543.4讨论563.4.1pGroEL-TAP 表达载体的构建及在 O157:H7 菌株