第一章 酶学和 与酶工程 (6~7节) 酶工程课件.pptVIP

3 胶过滤 这是利用葡聚糖凝胶sephdex G—25或G—50等能吸水膨润、而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的浓缩。通常采用“静态”方式，即将干胶直接加入样品溶液（干胶用量可根据胶的吸水量计算），胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分离浓缩的酶液。胶过滤浓缩法的优点是，条件温和，操作简便，也没有pH与离子强度等的改变。 4 冰冻浓缩 原理:溶液相对纯水融点升高,冰点降低。这有两种方式： 1.先将溶液冻成冰块。然后使之缓缓融解，这样几乎不含蛋白质和酶的冰块就浮于液面,而酶等则融解并集中于下层溶液(约为原体积的1／4); 2.让酶溶液缓缓冻凝，然后移去水形成的冰块. 问题:浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化,从而导致酶失效；其次是需要大功率的致冷设备. 5. 其它 还有聚乙二醇等浓缩法，它们一般只适用小量样品，而且往往成本很高。 （三）酶的纯化 在抽提液中,除了待纯化的酶外,通常不可避免地杂有其它小分子和大分子物质.其中小分子杂质在以后的纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决;大分子物质包括核酸,粘多糖和其它蛋白质.核酸和粘多糖往往干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中常会有大量核酸,最好设法预先除去.核酸可加硫酸链霉素,聚乙烯亚胺,色精蛋白或MnCl2等使之沉淀移去,必要时也可使用核酸酶.粘多糖则常用醋酸铅,乙醇,丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决,有时也可用酶。这些杂质移除后,余下的是杂蛋白. 纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是要将酶从杂蛋白中分离出来. 1、纯化方法的选择 　为了获得理想的分离效果应注意： 　第一，工作前应对所要纯化的酶的理化性质(溶解度、分子大小和解离特性)以及酶的稳定性等有一个较全面的了解，这样就可知道应选择哪些办法与条件，避免哪些处理，以及了解在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。 　第二，判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。一个好的步骤应该是比活力(纯度)提高多，总活力回收高（回收率高），而且重现性好。一般地说，纯化过程不宜重复相同的步骤和方法，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。 　第三，要严格控制操作条件，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、总的蛋白浓度下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，酶的稳定性亦越小，就更应注意防止变性。 2、酶的纯化方法 　现行的方法（根据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的）： （1） 根据溶解度的不同； （2） 根据分子大小的差别； （3） 根据解离电学性质的特点； （4） 利用稳定性的差异； （5） 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用的特点。 实际有许多方法中往往包含两种或两种以上的因素在同时起作用。 （四）结晶 所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，按规则且周期性排列的一种固体形式。 由于各种分子形成结晶的条件不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，也是一种酶和杂蛋白分离纯化的手段。 酶的结晶通常可以在较纯的酶液中添加硫酸铵、氯化钠等盐达到一定饱和度，使酶慢慢结晶出来。此时必须控制温度和pH值。盐浓度要逐渐提高，添加速度要慢，才能得到较好的结晶。有时在低温下，用丙酮、乙醇等有机溶剂进行结晶。近年来采用平衡透析法，即将酶液装入透析袋中，置于一定饱和度的盐溶液中进行透折，这种操作可以获得大量结晶。  为了获得纯净、粒大、收得率高的结晶应注意： (1)酶溶液应该达到相当的纯度 除了少数例外，不纯的溶液是不能得到结晶的。 (2)酶的浓度要恰到好处 一般以1—5％为宜，不宜小于0.2％，浓度高虽然较易结晶，但如果过于饱和，只能获得大量微晶，难以形成大晶体。 结晶方法： 1.盐析结晶 2.有机溶剂结晶 3.透析平衡结晶 4.等电点结晶 四. 酶的纯度和产量 （一） 活力测定 在酶的抽提和纯化过程中，为了了解所选择的方法和条件是否适宜，每一步骤前后都应进行酶的活力测定，作出总活力与比活力的比较。 如何进行酶的活力测定： (1)如果待分离的酶已有报导，可参考它所采用的测定方法和条件； (2)如果需要另建新的测定系统，那么就得先对该酶的作用、动力学性质等有所了解，据此来选择合适的底物和底物浓度、以及最适的反应pH和温度等，同时确定一种相应的测定方法。 测酶活时的注意事项: 一是测定用的酶反应时间应选择在酶反应的初速度范围内； 二是测定用的酶量必须和测得的活性有线性关系。 纯化过程中的酶活力测定还应考虑三个问题