蛋白酶对假丝酵母Candida sp.99-125脂肪酶生物合成过程影响.docVIP

蛋白酶对假丝酵母Candida sp.99-125脂肪酶生物合成过程影响 　　摘要：在利用豆粕为氮源生产脂肪酶的过程中，假丝酵母同化豆粕会产生蛋白酶，而蛋白酶在水解豆粕的同时，亦会水解诸如脂肪酶等其他蛋白类物质。发酵第4d时，蛋白酶活力达到最高值6.5U/ml，同时脂肪酶活力增长缓慢。在5U/ml的纯蛋白酶粉体系中，分别加入5000U/ml、10000U/ml的脂肪酶粉，反应4h后脂肪酶活力分别为2500U/ml、3900U/ml；在2个含有较高活力的蛋白酶的已除菌的发酵液体系中，40℃下自水解4h，脂肪酶活力损失分别为20.7%和21.2%。发酵前添加外源蛋白酶水解豆粕，可抑制假丝酵母产生蛋白酶，解除其对脂肪酶的影响，发酵周期可缩短4d。 　　关键词：脂肪酶发酵；蛋白酶；假丝酵母；酶活损失 　　中图分类号：S-3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0076-1 　　 　　0 前言 　　 　　脂肪酶(Lipase.EC 3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是酶制剂中的一员，它是一种重要的工业酶类，应用于油脂水解，食品风味和香味改进，生物能源等方面。脂肪酶是一种酯键水解酶， 将甘油三酯水解为甘油二酯、单甘酯、脂肪酸[1]。常见的包括假丝酵母( Candida sp.) [1-2]、根霉（Rhizopus）、青霉（Penicillium）和假单胞菌（Pseudomonadaceae）等产生的脂肪酶，其中假丝酵母是国内外研究较多的产脂肪酶菌种[3]。 　　在假丝酵母Candida sp.99-125以往的相关研究中，何耀强等讨论了诸如温度、pH、培养基原料、金属离子等因素对脂肪酶生物合成的影响；朱耀光等为提高菌体对豆粕的利用率，以豆粕水解液为氮源进行脂肪酶发酵；张亮等研究了脂肪酶生物合成过程中脂肪酸、甘油及脂类的变化规律，并发现油酸的消耗致使脂肪酶合成速率加大。而在已有的报道中，只是研究了一些小分子有机物对脂肪酶的影响[9]，而微生物发酵是一个复杂的过程，在假丝酵母合成脂肪酶的过程中，细胞自身会生成众多的酶及酶系，这些生成的酶及酶系必定对目的产物有着或多或少的影响，本文讨论了一种对脂肪酶生成影响最大的酶系――蛋白酶，在发酵过程中活力的变化，并对其降解脂肪酶做了相关的研究与分析，为脂肪酶发酵提供了一种新的改进方法及手段。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 主要试剂、菌种及培养基 　　1.1.1 试剂 假丝酵母脂肪酶，本实验室制备，酶活为10000U/g；中性蛋白酶，sigma公司，酶活为50000U/g；福林酚试剂，普博欣公司。 　　1.1.2 菌种 假丝酵母(Candida sp.99-125)，实验室保存。 　　1.1.3 培养基 初级种子液培养基（g/l）：豆油40，豆粕40，K2HPO4 2，KH2PO4 1；二级种子液培养基（g/l）：豆油40，豆粕40，K2HPO4 2，KH2PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.5；发酵培养基（g/L）：豆油40，豆粕40，K2HPO4 2，KH2 PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.5，加入适量消泡剂；豆粕水解发酵培养基（g/L）：豆油40，K2HPO4 2，KH2 PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.5，加入适量消泡剂；加豆粕40，按蛋白酶：豆粕：水=1:100:500（质量比）加入蛋白酶水解，40℃水浴搅拌水解3h。于121℃，20min灭菌灭酶后使用。 　　1.2 发酵过程条件 　　1.2.1一级种子培养 在250ml的锥形瓶中装入50ml一级种子液培养基，121℃下灭菌20min，冷却至26℃后在超净台从试管斜面上接种后放置于转速220r/min的旋转式摇床中，26℃下培养48h。 　　1.2.2 二级种子培养 在250ml的锥形瓶中装入50ml二级种子液培养基，121℃下灭菌20min，冷却至26℃后在超净台将一级种子液接种到二级种子液培养基中，置于转速为220r/min的旋转式摇床中，26℃下培养60h。 　　1.2.3 30L发酵罐培养 将发酵培养基（按15L装液量）配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌30min，冷却至26℃后接种，搅拌转速300r/min，通气量1L/（L#8226;min）。 　　1.3 蛋白酶水解脂肪酶过程及条件 　　1.3.1 纯蛋白酶粉对假丝酵母脂肪酶的水解作用 将蛋白酶配制成5U/ml（0.1g酶粉/L）的溶液，加入脂肪酶，40℃下恒温水浴，于一定时间内测定其脂肪酶活力。 　　1.3.2 发酵液自身对假丝酵母脂肪酶的影响 取一定时期内的发酵液，8000r/min离心5min取上清液，重复两次，尽可能