荧光分析原理讲座.pptVIP

绿色包装与生物纳米技术应用湖南省重点实验室 荧光分析原理讲座 ——实验室仪器培训课 主讲：贺全国博士 二、荧光原理(雅布伦斯基图 ) 荧光光谱的特点 Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系. 四、 荧光与分子结构的关系 1.共轭效应 ? →?* 跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基. 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大. 3,4-苯并芘 3. 取代基的作用 给电子基增强荧光： －OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N 吸电子基减弱荧光： －COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I 与?体系作用小的取代基影响不明显： －SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光: 五、 影响荧光强度的主要因素 1. 浓度：稀溶液，F∝c (?bc≤0.05) 2. 光源： F∝I0 ， 应强度大，稳定。 六、荧光光度计及荧光测定方法 荧光仪部件 激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光， 常用氙灯、高压汞灯或激光光源. 样品池: 石英池, 四壁透明. 单色器: 两个光栅单色器, 分置于样品池前后. 检测器: 光电池或光电倍增管, 与激发光成直角的 方向检测荧光. 荧光光度计光路图 测定方法—标准曲线法 1. 确定?ex和?em (激发光谱和发射光谱)； 2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(F), 根据工作曲线计算荧光物质的浓度. 七、 荧光分析法的特点和应用 灵敏度高：测定下限0.1～0.001 μg/mL, 比分光光度法高2～4个数量级。 （在黑背景下检测；光源的强度大） 选择性高： 适当选择激发光的波长和荧光测定的波长； 应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。 荧光光度法的应用 生物化学分析，生理医学研究，临床检测. 直接测定能产生荧光的物质. 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸. 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质. 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构； 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光； 无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形成荧光络合物。 荧光熄灭法测定猝灭剂 Ni2+对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+（ 6×10-5 ～6×10-3 ?g·mL-1） 用于测定无机离子的有机试剂 举例— 痕量3,4-苯并芘的测定: 八、 磷光分析法 获得较强磷光应采取的措施： 1. 低温， 低温磷光的样品装置 转筒式磷光镜（a）和转盘式磷光镜（b） * 1575年，西班牙医生N.Monardes发现。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，首次用于分析测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。 一、 分子荧光与分子磷光分析法发展 荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s 分子吸光与发光示意图 Jablonski Diagram Absorption Intersystem crossing, ISC, 10-2?10-6 s T1 h?A h?A 10-15 s Vibrational relax, VR, 10-12?10-14 s Internal conversion, IC, 10-11?10-13 s Fluorescence Phosphorescence IC ISC S0 S1 S2 3 2 1 0 10-8 s 10-3?100 s h?F h?P 吸收光谱 发射光谱 蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱） 激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:?ex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:?em 荧光分析法测定血清中的镁 镁-Oxine的激发光谱和发射光谱 ?/ 三、荧光定量分析的基础 —荧光强度(F/I )与物质浓度(c)的关系 在稀溶液中： F＝2.3Kφεb cI0＝2.3KφAI0 φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)： ε—荧光物质的吸光系数 b—液层厚度 I0—入射光