色谱分离第二章.pptVIP

2.4.2 展开 展开前色谱床及层析缸应先用溶剂蒸汽饱和——平衡。 展开方式：上行展开、下行展开、径向展开、水平展开（溶剂从两边向中间展开）. 优点：操作简单，重现性好. 缺点：展开时间 较长 ①上行展开法 ②径向展开法（水平法） 展开速度较上行法快 径向展开法 2.4.3定位与定性 定位方法 喷洒显色法：将显色剂溶液用喷雾器均匀喷洒在色谱床上; 熏蒸显色法：把滤纸或薄层板放入充满碘蒸气或氨水的密闭容器内使之显色; 紫外光显色法：含共轭双键的有机物可吸收紫外光显出暗色斑点或辐射出荧光。 ③双向展开法 点样后先用溶剂A使原点向垂直方向展开, 至溶剂达到前沿后停止(图b);用溶剂B再向与原方向垂直的另一方向展开,最后组分斑点将按45°方向分布(图c) a 色谱床的影响 Rf决定于物质的KD和两相的截面积. 滤纸的厚薄及其松紧程度、吸附剂的粒度均影响Rf值。 定性方法： （1）斑点的Rf值（或泳动距离）定性 影响Rf值（或泳动距离）的因素: b 相对湿度的影响 吸附剂的活度随相对湿度的增大而降低。 20cm×20cm的硅胶薄层板在50%的相对湿度中： 放置3分钟 失去活性一半 放置15分钟 吸附水分达最大值 薄层在相对湿度为1-80%的情况下展开，Rf值可以相差3倍。 最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，极性越大，相对湿度范围也相应增大。 c 溶剂系统的影响 溶剂系统不同，组分的分配系数不同，故Rf值不同。 在平面电泳中，溶液的离子强度增大，组分的泳动速度减小。 d 温度的影响 温度影响物质的分配系数KD，同时也影响纤维的水合作用，改变固定相的量。 e pH值的影响 pH值影响组分的电离情况，可以改变组分的移 动距离，甚至移动方向。 草酸: COOH COOH COO COOH COO COO 值最大 值最小 展开后出现三个斑点 电离度增大，极性增大，在极性较强的一相中溶解度增大。 解决方法：可以加入强酸抑制电离。 为控制电泳速度，必须使用缓冲溶液 对于两性物质，溶液的pH值可以影响其所带的电荷，故而影响电泳方向。 R C COO- NH2 — — — H+ R C COO- NH3+ — — — R C COOH — — — NH3+ pH等电点 pH＝等电点 pH等电点 向正极移动 不动 向负极移动 f 电渗的影响 在电场中，液体对于一个固定的固体表面作相 对运动称为电渗，移动的速度称为电渗速度。 质点的实际泳动速度应等于粒子本身的泳动速度与电渗速度的向量和。 所以，中性物质在电场中也可能移动 g 其他因素 展开方式、点样位置、展开距离、样品浓度等 （2）斑点的显色特性 观察斑点的颜色或荧光，或用专属指示剂显色与对照品比较定性. （3）斑点的原位光谱扫描 a 紫外－可见光扫描 颜色斑点:400－780nm扫描 斑点有紫外吸收:200－400nm扫描 斑点的扫描光谱与比较品的扫描光谱比较定性。 b 三维光谱扫描 用平面色谱对粗提物进行分离与纯化，然后再用其他方法分析、鉴定。 （4）与其他分析技术联用 （1）半定量 a 目测比较法 将一系列已知浓度的对照品溶液与一定量已知浓度的样品溶液点在同一色谱床上，经展开定位之后，根据样品与对照品中组分斑点的颜色深浅和面积大小估计含量。 2.4.4定量方法 b 限量检查法 用已知对照品溶液与供试品溶液分别点样、展开、显色、检查供试品中所含对照品的限度。 此种方法普遍用于合成药物的纯度检查。 （2）定量 a 间接定量法（洗脱测定法） 用溶剂将化合物的斑点定量地洗脱下来，然后用适当的方法测定。 b 直接测量（原位薄层扫描法） * 第2章 平面色谱 2.1概述 2.2滤纸及薄层板 2.3平面色谱的流动相（展开剂） 2.4平面色谱的操作方法 2.5高效薄层色谱法（HPTLC） 2.1.1平面色谱法的分类与原理 平面色谱是一种开放式的离线操作色谱， 分类如下： 纸色谱法 薄层色谱法 薄层电泳法 2.1概述 纸色谱法 以滤纸为载体的液相色谱法。 滤纸中的纤维素能吸收20~25%的水分，其中6%左右的水分通过氢键与纤维素上的羟基相结合，形成液-液色谱中的固定相。 固定相：滤纸上的结合水