【精品文档】狂犬病抗体检测定稿.pptVIP

枕骨大孔插入 眼角插入 狂犬病脑组织标本的采集 经上眼窝用抽吸式采样针采集样品 脑样品采集 脑标本的保存和运输 运输过程应将标本放入带冰排或干冰的冷藏包 中进行。 将标本放入15ml离心管并对标本进行编号； 将编好号的离心管放入带冰排的冷藏包中储存； 标本采集完成后尽快放入－20℃或－70℃冰箱 进行保存； 狂犬病病原学检测 直接免疫荧光方法（DFA） 巢式PCR方法 直接免疫荧光法（DFA）检测狂犬病毒抗原 将脑组织在载玻片上制成印片，室温干躁，冷丙酮固定； 在相应的组织印片位置滴加狂犬荧光抗体，使其与抗原充分结合； 洗涤，去除非特异性荧光，封片，荧光显微镜观察 。 RT-PCR方法法检测狂犬病毒核酸 设计两对狂犬病毒核蛋白基因特异引物 第一对：F1: 5’ - （55） ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG（74） -3’ R1: 5’ - （1570） CAG TCT CYT CNG CCA TCT（1587） -3’ 第二对：F2: 5’ - （644） AAG ATG TGY GCY AAY TGG AG（663） -3’ R2: 5’ - （881） GCC CTG GTT CGA ACA TTC T（899）-3’ 优点： 1、较普通PCR扩增灵敏度有效提高，提高检出率。 2、较普通PCR扩增特异性更强，有效避免假阳性。 RT-PCR法（巢式）检测狂犬病毒核酸结果 1 2 3 4 5 6 7 9 第一次PCR产物凝胶电泳照片 第二次PCR产物凝胶电泳照片 14 15 16 17 21 25 27 28 29 30 32 33 33 1 2 3 4 5 6 7 9 14 15 16 17 21 27 28 29 30 32 33 25 M M 23 24 26 1532bp 255bp 2000bp 1000bp M:DL2000 M:DL2000 唾液中病毒RNA的检出 (Adapted from Crépin et al., 1998) 间歇性排毒 反复收集样品 病例 1: D20 D21 D22 D23 D24 结果: 0 + + 0 + 病例 2: D4 D5 D6 D7 D9 to D17 结果: + + + + 0 尿液中病毒RNA的检出 病例 1: D5: 唾液 -, 脑脊液 -, 尿 - D6: 唾液 - 病例 2: D2: 唾液 +, 尿 + 病例 3: D4: 唾液 +, 尿 +, 脑脊液 - 病例 4: D4: 唾液 +, 尿 -, 脑脊液 - D5: 唾液 -, 尿 - D10: 唾液 -, 尿 - (Adapted of Wacharapluesadee et al, 2002) 狂犬病诊断样品 活检 早期、多次采样 样品 临床期 样品保存温度 0-8 days 8 days 运输温度 唾液 +++ +++ -20°C 尿 +++ ?? -20°C 皮肤活检 +++ ++ -20°C 血清 + ++ -20°C 脑脊液 (+) (+) -20°C 死后诊断 脑检查(+4 or -20°C) 样品运输参照有关传染性材料规定进行 55例狂犬病人死前实验室确证结果 (Crepin et al., 1998) 谢 谢！ * * 狂犬病血清学检测 血清学检测 血清学包括检测和评估血液／血清中的免疫成分 血清或脑脊液中狂犬病特异性抗体的存在表明曾经有狂犬病抗原的暴露 狂犬病特异性抗体的测定还可用于评估免疫后的个体体液免疫水平和狂犬病人的诊断目的。 如何选择检测方法 保护狂犬病感染依赖于狂犬病中和抗体的存在。因此，检测和定量狂犬病中和抗体的方法，如小鼠中和试验﹑快速荧光灶抑制试验（RFFIT）﹑荧光抗体病毒中和试验（fluorescent antibody virus neutralization test）成为被推荐的用于狂犬病血清中和抗体定量检测方法。 敏感﹑特异﹑精确度的要求应该成为选择试验方法首先考虑因素. 实验室材料﹑仪器和安全设备也必须考虑。 选择适合检测狂犬病抗体的试验时，准确地理解涉及到抗体反应时将测定哪一种成分. 狂犬病免疫反应 免疫反应的特异性是由用于产生抗体的狂犬病毒上存在的独特抗原决定簇所决定。完整的狂犬病毒诱发的抗体形成有可能抵抗病毒所有的蛋白，但主要抗狂犬病毒糖蛋白和核蛋白。 研究能够中和狂犬病毒的单克隆抗体表明这些单克隆抗