《超分辨荧光成像技术》细胞成像技术小组展示.pptVIP

受激发射损耗显微技术（STED）-优缺点 优点： 1.可以快速地观察活细胞内实时变化的过程。如神经元突触小泡运动的实时成像视频记录. 应用 STED 技术已经可以以视频的速度(每秒 28 帧)来采集记录神经细胞内突触小泡的高分辨率图像(50 nm)。 缺点： 1.可能发生荧光漂白 ,这个过程是不可逆的 ,影响到荧光的发光效果 ,会削弱系统的分辨率。 2.光路复杂，设备昂贵，对系统的稳定性要求很高 基于单分子成像的超分辨技术 第二篇 1.随机光学重构显微技术（STORM） 随机光学重构显微技术即stochastic optical reconstruction microscopy（简称STORM），是一种基于单分子成像的超分辨率显微成像方法。2006年底，美国霍华德-休斯研究所的华裔科学家庄小威实验组开发出来这种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白、DNA等的超分辨率定位。 STORM基本原理 是利用高精度荧光分子定位技术和荧光分子开关技术来实现超分辨成像。关键：荧光染色对 Cy5-Cy3 STORM成像过程 激发态Cy 5 633nm激光 532nm激光 基态Cy 5 CompanyLogo CompanyLogo 超分辨荧光成像技术 汇报 5 超分辨显微成像技术 定义：远场条件下基于荧光的，“突破”衍射极限的光学显微成像技术。 1.衍射极限 阿贝光学衍射极限： 可见光波段（400-700nm）,水的折射率为1.33，而sinθ最大为1，则其分辨率极限为150nm.实际上NA(数字孔径)为约为1.也就是说在两个点光源相距200nm以内时，Airy disk 有很大重叠而无法分开。 2.“突破”光学光学显微成像的衍射极限 衍射极限为远场效应，在近场下无效。 通过应用一系列物理原理 、化学机制和算法“ 突破”了光学衍射极限,把光学显微镜的分辨率提高了几十倍 ，使我们能以前所未有的视角观察生物微观世界。 d: 分辨率 ； λ:光波波长 θ：聚焦光锥的半角 n : 介质的折射率 分类 1.通过调制照明光斑缩小系统的点扩散函数来实现超分辨成像；基本思想是：在激发光斑点扩散函数周围套上一个环形点扩散函数，以“ 擦 除”激发光斑的外 围，从 而使得 激 发光 斑 “ 变小 ”。 包括受激发损耗显微技术（STEM）;可逆饱和线性荧光跃（RESOLFT)；饱和结构光照明显微技术（SSIM） 2.基于单个荧光分子的定位 ；虽然 Abbe 衍射极限指出无法区分相距约 200nm 的两个荧光分子 ，但是通过提取单个荧光分子的爱里斑信息却可以实现对这个荧光分子 的精确定位 。 包括光激活定位显微技术（PALM）;随机光学重构显微技术（STORM） 1.饱和结构照明显微技术（SSIM） 2.可逆饱和线性荧光跃迁（RESOLFT） 3.受激发损耗显微技术（STED） 4.随机光学重构显微技术（STORM） 5.光激活定位显微技术（PALM） 缩小系统 的点扩散 函数 单个荧光 分子定位 基于缩小PSF的超分辨成像技术 第一篇 SSIM的特点 1.无论是线性还是非线性结构光照明所获取的显微图像都比常规显微图像具有更清晰、更丰富的细节结构。 利用常规显微镜、常规滤波、线性结构光照明以及采用 2 级谐波的 非线性结构光照明对细胞微管所成图像。比例尺500nm 2.观察生物样品的动态特性 要观察生物样品的动态特性就要有较高的成像速度，结构光照明荧光显微镜只需要获得几幅初始图像即可重构超分辨图像的特点使其能满足这种成像速度要求。如3D-SIM分析了不同细胞周期状态下人体细胞中心体的中心粒与中心粒周围基质之间的空间关系. 3.相比于其他超分辨荧光显微技术而言，结构光照明荧光显微镜提升分辨率的能力偏低。 超分辨荧光显微镜术 分辨率 光激活定位显微技术 1nm 随机光学重构显微技术 20-30nm 受激发损耗显微技术 大约50nm 饱和结构照明显微技术 径向 100 nm 、轴向 约200 nm 可逆饱和线性荧光跃迁（RESOLFT） 图 1 RESOLFT过程的原理图 A→B的转移过程可以由入射光来驱动。而反转移过程 B→A 可以由任意形式的能量来驱动，如光、化学反应、热能，甚至是自发辐射等。 I 决定荧光分子的状态；定义饱和光强