淋巴液引流技术改进及脓毒症大鼠淋巴液的代谢组学分析-improvement of lymph drainage technique and metabolomics analysis of lymph in septic rats.docx

中文摘要研究背景：脓毒症是重症监护病房中患者的首要致死原因, 是危重病急救医学研 究的重点和难点，其发病机制非常复杂。最近的研究表明，肠道淋巴管作为主要的非 细菌性的肠源组织损伤因子的通路，可引发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功 能障碍综合征（MODS）。尤其是 MODS 肠道淋巴液假说的提出更突显了淋巴液在炎 症反应中的作用。因此，对淋巴液在脓毒症中的作用进行研究有助于更深入认识脓毒 症的发病机制，为脓毒症的诊断和治疗提供新的思路。第一部分：建立大鼠胸导管淋巴液引流及脓毒症盲肠结扎穿孔模型 目的：为了便于研究淋巴液在脓毒症和 MODS 中的作用，建立理想的淋巴液引流动物模型对研究具有重要的意义。方法：20 只 SD 雄性大鼠用 10%水合氯醛，按 0.35mL/100g 对大鼠进行腹腔内注 射麻醉。经左侧腹膜后寻找腹主动脉，沿腹主动脉左侧寻找淡乳白色的胸导管，钝性 分离后放置预先弯成“U”型的聚乙烯导管 PE50 引流管，双重结扎并将导管固定在 后腹壁上防止导管滑脱。将导管穿出背部皮肤连接真空采血管并固定在大鼠背部。每 2 小时收集一次样本，连续观察 12 小时。对引流的淋巴液样本进行计量、蛋白定量 和淋巴细胞计数检测。另外将 60 只 SD 雄性大鼠按照盲肠结扎比例（25%、50%和 75%）随机分成三组，每组 20 只。按上述麻醉方法麻醉后，用 1-0 丝线结扎盲肠， 并用 22#针头对穿盲肠一次,连续观察 8 天。留取脓毒症大鼠的肝、肺和小肠组织，常 规制备病理组织切片，观察肝、肺和小肠组织的形态学变化。应用鲎试剂动态浊度定 量测定法测定大鼠淋巴液中内毒素（LPS）水平并用 ELISA 法检测大鼠淋巴液中 IL-1β、IL-6 以及 TNF-α 的水平。结果：胸导管淋巴液引流模型的成功率为 95%，平均手术时间为 35-40 分钟/只。 放置胸导管引流后 12 小时内淋巴液引流量平均为 0.71±0.33 ml/h；淋巴液中蛋白质的浓度没有随着引流时间的增加而明显的下降，平均为 37.14 ± 2.59 mg/ml；淋巴细胞 的数量却有很大的波动，范围在 0.08×106-12.17×106 个/ml 之间。在穿刺针头一定的 情况下，随着盲肠结扎长度的增加，脓毒症大鼠生存时间与生存率均显著下降 (p0.01)。盲肠结扎的长度在 25%，50%和 75%组可以观察到其中位数生存时间分别 为 8 天，4.5 天和 2.2 天。形态学观察可见脓毒症大鼠的肝细胞排列紊乱，中央静脉 和肝窦淤张，有肝细胞坏死和渗出；肺组织结构被破坏，基膜增厚，肺泡内充满了渗 出的液体，部分肺泡内还有血性的渗出；小肠绒毛水肿，大量淋巴细胞浸润在粘膜下 层和肌层，Peyers 淋巴结明显增大。检测结果 LPS 对照组为 0.76±0.41（pg/ml）、脓毒症组为 13.56±5.04（pg/ml）；IL-1β 对照组为 90.48±28.5（pg/ml）、脓毒症组为627.92±98.96（pg/ml）；IL-6 对照组为 87.51±34.86（pg/ml）、脓毒症组为 1353.67±209.4（pg/ml）； TNF-α 对照组为 51.46±21.88（pg/ml）、脓毒症组为 401.26±72.08（pg/ml）。 各种指标在脓毒症组均明显上升，两组间差异有显著性（p0.05）。结论：本研究中采用了自行设计了一套独创的淋巴液收集系统。采用这套系统可 以允许大鼠在清醒、自由进食进水的情况下连续收集淋巴液样本，最大程度减少了对 大鼠生理状态的干扰。在结扎盲肠比例在 50%的情况下，脓毒症大鼠的炎症反应情况 和死亡率能够满足本课题的需要，因此在以后的实验中均采用该方法了造大鼠的脓毒 症模型。脓毒症大鼠的肝、肺和小肠组织有明显的形态学改变，淋巴液中的炎症因子 也较正常对照组明显升高。第二部分：脓毒症大鼠淋巴液诱导血管内皮细胞损伤的研究 目的：本研究采用脓毒症大鼠胸导管淋巴液诱导人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilical vascularendothelial cells，HUVEC)损伤，通过对内皮细胞损伤的研究为脓毒症的发病机制研究奠定基础。方法：1)首先扩增 HUVEC，将 HUVEC 与淋巴液共同孵育。应用 MTT 比色法检 测脓毒症大鼠淋巴液不同浓度（2%、4%、6%、8%、10%）对 HUVEC 的抑制率， 接下来再检测脓毒症大鼠淋巴液不同作用时间（2h、4h、6h、8h）对 HUVEC 的抑制 率。2) 用流式细胞仪检测脓毒症大鼠淋巴液作用后的 HUVEC 细胞的损伤情况。3） 将淋巴液作用后的 HUVEC 爬片固定、HE 染色、观察内皮细胞的形态学改变。4）电 镜检测淋巴液作用后的 HUVEC，观察其微观结构改变。