禽霍乱与大肠杆菌病多价二联蜂胶灭活疫苗研制.docVIP

禽霍乱与大肠杆菌病多价二联蜂胶灭活疫苗研制 　　摘要：为研制禽霍乱与大肠杆菌病多价二联灭活疫苗，本研究以禽多杀性巴氏杆菌强毒株C48_1、C48_2和禽致病性大肠杆菌常见血清型K88、K4等为制苗菌株，以牛肉汤进行高密度培养制备抗原，将灭活的抗原铺以具有广谱生物学活性的天然物质蜂胶为免疫增强剂，制备禽霍乱与大肠杆菌病多价蜂胶二联灭活疫苗。试验结果表明，疫苗安全可靠，无明显的干扰现象，免疫后5-7d产生坚强保护力，对禽霍乱和鸡大肠杆菌病的近期保护率均为87%，疫苗保护期为6个月。以实验动物小鼠代替本动物进行二联疫苗效检取得成功，本效检方法可缩短检验期限7d，降低检验成本，具有更敏感、更特异、更客观、更简便等特点。? 　　关键词：禽霍乱 大肠杆菌病 蜂胶 灭活疫苗 　　 禽霍乱和禽大肠杆菌病是家禽的两种流行广泛而且危害严重的主要传染病，给养禽业带来重大的经济损失。???关这两种病的防治国内多以药物防治为主，但由于大肠杆菌极易产生耐药性，一旦停药后，这两种病又易反复发作，临床应用效果不理想。反复用药，还可导致菌群失调，造成更大的损失，甚至产生药物残留，造成食品安全危机，影响国际贸易。本研究在完成禽霍乱蜂胶灭活疫苗和禽大肠杆菌病多价蜂胶疫苗的基础上研制出禽霍乱与大肠杆菌病多价蜂胶二联灭活疫苗[1]。? 　　1 试验材料? 　　1.1 制苗用菌株。鸡多杀性巴氏杆菌C48-1强毒株C48-2强毒株；鸡致病性大肠杆菌强毒株2株，血清型分别为K88、K4型由预防实验室保存。? 　　1.2 试验动物。试验用鸡购于圣景园畜禽养殖基地1日幼龄雏，饲养至40日龄。小白鼠购买于天硕生物制品公司。 　　1.3 试验试剂与药品。制苗用培养基为牛肉汤、甲醛、营养琼脂、葡萄糖、氢氧化钠、浓氨水、硫酸铝钾、蒸馏水等。? 　　1.4 试验器材。培养皿、试剂瓶、高压锅、水浴锅、电炉、接菌环、酒精灯、手术刀、剪刀、注射器等[2]。? 　　2 试验方法? 　　2.1 疫苗的制备。鸡多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌二联灭活菌液按《兽用生物制品规程》方法制备。? 　　2.1.1 制苗用培养基牛肉汤的制备：取2斤精瘦牛肉切成碎末加1000ml水放入高压锅加热4-6h后冷却后用四层纱布过滤，不足1000ml加蒸馏水补足，放入灭菌瓶中保存备用。用天平分别称取5g氯化钠、10g蛋白胨和1g葡萄糖放入上述牛肉汤中。调节牛肉汤的PH值至中性。将牛肉汤分别装入2个500ml的灭菌瓶中每瓶500ml，放入高压锅中高压灭菌备用。? 　　2.1.2 氢氧化铝胶的制备：浓氨水10mL加蒸馏水90mL，装入瓶内。硫酸铝钾20g加蒸馏水200mL，加热到60℃，放入瓶内。将（1）液加入到（2）液中，慢加快搅，当（1）液剩约10mL时，停止加入，测PH（6～9左右）。静置弃上清，用蒸馏水洗3～4次，每次均静置弃上清。测PH，分装后再静置，弃上清，高压备用。? 　　2.1.3 菌液培养：将菌种接种于普通肉汤，培养24小时后，进行大量扩增菌液至所需量后加甲醛灭活。? 　　2.1.4 配苗：分别取鸡多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌灭活菌液5份加灭菌氢氧化铝胶1份，充分混合均匀后，静置沉淀2-4d，弃去部分上清液，浓缩至全量的3/4，取样做无菌检验。将无菌检验均合格的上述浓缩菌液按3：1的比例混合，并按混合后总量的0.005%加入硫柳汞，充分混匀[3] 。? 　　2.2 疫苗检验。物理性状、无菌检验、安全性检验、效力检验等按《兽用生物制品规程》检验。? 　　2.2.1 二联疫苗对小鼠的免疫效力试验。用二联疫苗免疫实验动物小鼠。将20g重的小鼠分为5组，1至4组每组各10只小鼠，第5组设为对照组为8只小鼠，1至4组每组免疫剂量为0.2mL/只，对照组每只注射0.2mL的生理盐水。对小鼠免疫后的第7d、30d、60d、180d后分别对第1至4组用致死量禽霍乱和大肠杆菌菌液攻毒，测定免疫效力。对1至4组攻毒同时每次分别取对照组2只小鼠进行功毒。试验小鼠攻毒后连续观察7d，记录各组发病、死亡情况[4]。? 　　2.2.2 二联疫苗对本源动物鸡的免疫效力试验。对本源动物鸡的测定。将40日龄鸡分为5组，1至4组每组各30只，第5组设为对照组为8只，每组免疫剂量为1.5mL/只，对照组每只注射1.5mL的生理盐水。免疫7d、30d、60d、180d后分别对第1至4组用致死量禽霍乱和大肠杆菌菌液攻毒，测定免疫效力。对1至4组攻毒同时每次分别取对照组2只鸡进行功毒。试验鸡攻毒后连续观察7d，记录各组发病、死亡情况[5]。? 　　3 结果与分析? 　　3.1 结果。? 　　3.1.1 疫苗的物理性状观察。? 　　3.1.1.1 剂型：乳黄色或黄褐色均匀乳状混悬液久置底部有沉淀，充分摇匀后成均匀乳状混悬