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变形链球菌总蛋白质几种提取方法比较研究 　　摘 要:目的 对变链菌总蛋白质的几种提取方法进行比较研究，寻找出最佳的提取方法。方法 分别用超声裂解法、热裂解超声法及反复冻溶超声裂解法来提取变链菌总蛋白质，再对提取的蛋白质进行浓度的测定。结果 反复冻溶超声裂解法所得的蛋白质浓度比其它两种方法高。结论 通过实验对比寻找到了一种有效提取变链菌总蛋白质的方法，为进一步研究变链菌蛋白表达及其对致病性的影响奠定了基础。 　　关键词:变形链球菌；总蛋白质；提取方法 　　 　　变形链球菌（简称变链菌）是口腔龋病的主要病原菌，在龋病防治的研究中，变链菌蛋白质组学研究逐渐成为一个新的研究热点。对变链菌总蛋白质进行有效的提取，是开展变链菌蛋白质组学研究的基础。国外文献曾分别报道了几种变链菌总蛋白质的提取方法[1～3]，但未见对这几种提取方法进行比较研究的相关报道。我们在参考国内外相关文献的基础上，对几种提取变链菌总蛋白质的方法进行了系统的比较研究，期望找到一种有效、简单且稳定的提取方法，为进一步开展变链菌蛋白质组学的研究奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料： 　　变链菌（S.mutans）Ingbritt C (血清C型) 国际标准株 　　培养基：BHI液体培养基，BHI固体培养基 　　裂解液Ⅰ：50mM Tris-Hcl,0.3％ SDS,0.3％ DTT，调节pH至8.0 　　裂解液Ⅱ：30mM Tris-Hcl，7M 脲，2M 硫脲，4％ CHAPS，5mM PMSF，调节pH至8.0 　　1.2 实验方法 　　(1).细菌的培养和收集：将变链菌Ingbritt C标准株从-70℃冰箱中取出，常规复苏，接种于BHI固体培养基，37℃厌氧条件下（80?N2,10?H2, 10?CO2）培养2天后挑取单菌落接种于200mlBHI液体培养基，培养20h后，于4℃、3000rpm离心l5min收集细菌沉淀，洗涤两次后重悬于20ml生理盐水中，震荡混匀后等分为20等份，再次于4℃、3000rpm离心l5min，细菌沉淀保存于-20℃，备用。 　　(2).细菌的裂解： 　　超声裂解法：将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，加入1ml裂解液Ⅰ，超声破碎(11KHZ，10S×10次循环，间隔30S，冰浴)，振荡(30S×5，间隔30S，冰浴)，取10μl混悬液涂片进行革兰氏染色。剩余混悬液于4℃、10000rpm离心l5min，收集上清液，取200μl上清液加入4倍体积预冷丙酮沉淀蛋白质，真空冻干为蛋白质粉末保存于-20℃，备用。同时处理3份平行样本； 　　热裂解超声法：将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，100℃沸水浴15min，加入1ml裂解液Ⅰ，其余步骤同方法1； 　　反复冻溶超声裂解法：将保存的细菌沉淀反复冻溶3次（-20℃ 30min，20℃ 10min），加入1ml裂解液Ⅱ，其余步骤同方法1。 　　(3).蛋白质浓度的测定：用1ml超纯水溶解制备的蛋白质粉末，用Bradford蛋白质定量试剂盒测定蛋白质的浓度，测定时每种蛋白质粉末设定3个平行样本。同时绘制标准曲线及样本加标回收，标准曲线蛋白质浓度范围为0mg/ml～2mg/ml。 　　2 结 果 　　2.1 提取蛋白质的浓度分析：蛋白质标准曲线为y=0.115+0.823x，相关系数为0.985。样本加标回收率为88.923％。蛋白质粉末在超纯水中的溶解性不佳，溶液中明显存在未溶解的蛋白质颗粒。三种方法所得的蛋白质浓度见表1，方法3所得的蛋白质浓度比其它两种方法高20余倍。 　　表1. 三种方法提取的蛋白质浓度 　　 方 法1 方 法2 方 法3 　　蛋白质浓度（mg/ml） 0.0623 0.0712 1.4385 　　 　　2.2 细菌破碎程度分析： 　　未经裂解处理的变链菌为革兰氏染色阳性球菌，呈长链状排列（图1）；经方法3处理后细菌呈分散状态，在染色阳性的菌体周围出现染色阴性的菌体碎片（图2），方法1和方法2处理与方法3无明显的差异。 　　 　　图1.未裂解的变链菌 　　（革兰氏染色，×1000） 　　 　　图2. 经方法3处理后的变链菌 　　（革兰氏染色，×1000） 　　3 讨 论 　　变链菌在人类口腔微环境中占有重要的生态地位，是公认的主要致龋菌。变链菌蛋白质组学为龋病的防治研究提供了一个新的途径和平台[1～3]，而其中首要和关键的步骤是提取细菌总蛋白质[4, 5]。有效提取细菌总蛋白质的一个必要步骤就是裂解菌细胞，裂解细胞通常有机械法和非机械法两种方法。非机械法通常是加入一些能降解细胞壁成分的物质（如溶菌酶等）来裂解细胞[1]，其主要缺点是会引入外源性蛋白质，从而影响后续分析[6]；机械法虽克